聶文冰，尹鴻萍

(中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198)

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T,CAR-T)療法是一種在體外分離患者T細胞后，利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)座子技術(shù)等對T細胞進行修飾，使其攜帶CAR基因，在回輸入患者體內(nèi)后對腫瘤細胞進行識別并殺傷的技術(shù)。其發(fā)揮作用的關(guān)鍵在于CAR的設(shè)計。CAR主要包含3個部分：胞外抗原識別區(qū)ScFv，跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號區(qū)。根據(jù)胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的不同，其又可分為4代[1-2]，一代CAR胞內(nèi)部分只含有CD3-zeta結(jié)構(gòu)域，修飾后T細胞擴增困難，體內(nèi)實驗顯示其在小鼠體內(nèi)的持久性較弱，因而療效不佳[3]；二代CAR中除了CD3-zeta結(jié)構(gòu)域，額外含有一個共刺激結(jié)構(gòu)域如CD28、4-1BB等，可顯著促進T細胞擴增；三代CAR中包含兩個共刺激結(jié)構(gòu)域，CD28、4-1BB、OX40等；四代CAR將額外的分子原件如自殺基因，白介素基因等插入到CAR中一方面提高CAR的安全性，另一方面表達功能蛋白，使其更好地發(fā)揮作用[4]。目前CAR-T療法在血液瘤中包括急性B淋巴細胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤等的治療方面取得了顯著成效。然而其針對實體瘤的治療仍有待解決，主要是實體瘤中合適的靶點尋找受限、T細胞難以浸潤腫瘤部位以及腫瘤微環(huán)境的免疫抑制等原因引起[5]。

為了確保CAR-T的療效需要T細胞在體外能夠快速增殖。目前IL-2已經(jīng)是公認(rèn)的可促進T細胞增殖的細胞因子。在naive T細胞被激活后，效應(yīng)T細胞可分泌IL-2并且增加IL-2受體的表達，從而促進T細胞的增殖。但是其本身對體內(nèi)存在的naive T細胞以及memory T細胞的促增殖作用有限。在研究中，實驗者常常額外加入IL-7/IL-15來確保T細胞的增殖能力，本文主要就IL-7、IL-15促增殖作用的機制以及其在CAR-T免疫療法中的臨床應(yīng)用進行綜述。

1 IL-7及IL-15的作用原理

1.1 IL-7的作用原理 人IL-7是一種由骨髓基質(zhì)細胞分泌的，分子量為25 kDa左右的糖蛋白[6]。其基因長度為72 kb，位于染色體8q12～13上，由177個氨基酸構(gòu)成。分子上含有3個糖基化位點，根據(jù)糖基化程度的不同，體外蛋白水平檢測時可于20、25、28 kDa左右出現(xiàn)3條蛋白條帶。IL-7的受體由高親和力受體α鏈(CD127)以及γc鏈(CD132)組成異二聚體[7-8]。

如圖1所示，當(dāng)IL-7與其受體結(jié)合后，主要依賴兩條信號通路發(fā)揮作用：JAK-STAT通路以及pI3K-AKt通路[9-10]。經(jīng)pI3K-AKt通路，IL-7一方面下調(diào)細胞周期相關(guān)抑制蛋白p27kipl的表達，另一方面促進周期蛋白cyclinD1的表達，從而促進細胞周期進展，誘導(dǎo)細胞增殖。另一方面，當(dāng)IL-7與其受體結(jié)合后會導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)JAK1及JAK3的激活，磷酸化STAT蛋白。磷酸化的STAT蛋白會形成異二聚體然后進入細胞核激活抗凋亡基因如Bcl-2和Mcl-1表達，抑制促凋亡蛋白如Bax和Bak等的表達，從而促進細胞存活。通過上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，IL-7可促進自身Naive T細胞以及記憶T細胞的增殖，對CAR-T療法具有重要意義。

圖1 IL-7的信號通路圖

1.2 IL-15的作用原理 IL-15因子于1994年被Giri等[11]發(fā)現(xiàn)并命名，其編碼基因位于染色體4q31上，由162個氨基酸構(gòu)成分子量為14～15 kDa的糖蛋白。其中48個氨基酸構(gòu)成前導(dǎo)序列，114個氨基酸形成成熟的IL-15亞基。IL-15分子中含有2個二硫鍵以及2個糖基化位點使其構(gòu)成4個α-螺旋束結(jié)構(gòu)。IL-15的受體同IL-2一樣為異源三聚體，由IL-15Rα、IL-2/15Rβ及γc鏈組成。其是除IL-2外，唯一與IL-2共享受體β鏈的因子[12]。

如圖2所示，多數(shù)情況下IL-15與高親和力配體IL-15Rα結(jié)合形成復(fù)合物表達于多種細胞表面。當(dāng)細胞被激活后，信號經(jīng)IL-15/IL-15Rα反式遞呈到表達β/γc受體的效應(yīng)細胞中，主要經(jīng)JAK/STAT、pI3K-AKt以及MAPK 3條信號通路調(diào)節(jié)下游效應(yīng)分子如Bcl-2、Bim、NF-κB、IFN-γ等發(fā)揮作用[13-15]。當(dāng)JAKs被激活后，一方面促使STAT磷酸化入核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達；另一方面，通過接頭蛋白Shc激活Grb2，Grb2既可作用于GAB2蛋白經(jīng)pI3K-AKt通路促進細胞增殖及存活，又可與鳥嘌呤核苷酸交換因子SOS結(jié)合形成Grb2-SOS復(fù)合物經(jīng)Ras-Raf途徑進一步激活MAPK來促進細胞增殖。與IL-7作用區(qū)別在于其主要經(jīng)反式信號傳遞來發(fā)揮作用，從而促進記憶T細胞，特別是CD8+記憶T細胞的增殖。

圖2 IL-15的信號通路圖

2 IL-7及IL-15的體內(nèi)外作用

2.1 促進CAR-T細胞的體內(nèi)外增殖 Zhou等[16]利用一個攜帶eGFP標(biāo)簽的anti-CD19 (4-1BB) CAR，轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細胞后，比較其在不同因子IL-2或IL-7/IL-15共刺激條件下，細胞的增殖、凋亡以及抗腫瘤作用的差異。盡管IL-2組細胞在2周內(nèi)可擴增100倍左右，但是經(jīng)IL-7/IL-15共培養(yǎng)，細胞的擴增倍數(shù)約為IL-2組的2倍多。并且抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，細胞具有低凋亡率。此外有研究顯示在IL-2 (50 U·mL-1)中培養(yǎng)的T細胞從第20天開始細胞即有數(shù)量減少的趨勢，而在IL-7 (10 ng·mL-1)和IL-15 (10 ng·mL-1)中培養(yǎng)的T細胞在培養(yǎng)至35 d時仍有較好的擴增趨勢[17]。Hoyos等[18]將CAR-19+與自殺基因iC9、細胞因子IL-15共表達，構(gòu)成一個新型的CAR載體，將其與常規(guī)的CAR19+相比較，每周以效靶比1∶2的比例用B細胞慢性淋巴性白血病CD19+刺激，共培養(yǎng)5周，作者發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的新型CAR體外擴增相較于CAR-19+增加10倍。此外，將CAR-T細胞經(jīng)eGFP-FFLuc基因編輯后，經(jīng)小鼠體內(nèi)研究顯示攜帶IL-15的新型CAR-19+的擴增速度要優(yōu)于CAR-19+3～15倍。

盡管在CAR-T研究中IL-2已有顯著的促增殖作用，但是其本身對部分T細胞的促增殖作用有限，通過與IL-7、IL-15聯(lián)合作用，可顯著提高整體CAR-T細胞的擴增速率，從而在確?；剌攧┝康臈l件下可縮短培養(yǎng)時間，一方面減少操作時間，更易確保產(chǎn)品的質(zhì)量；另一方面保持CAR-T細胞的活性以達到最佳療效。

2.2 調(diào)節(jié)細胞表型，減弱細胞分化，促進存活 Xu等[19]比較了100 U·mL-1的IL-2與10 ng·mL-1的IL-7及5 ng·mL-1的IL-15培養(yǎng)條件下，CAR-T擴增后表型變化以及體內(nèi)外抗B細胞惡性腫瘤的差異。研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-7/IL-15培養(yǎng)后，CAR-T終產(chǎn)品中CD8+CD45RA+CCR7+占比要明顯優(yōu)于IL-2培養(yǎng)組(31%±4% vs 14%±5%)。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)攜帶IL-15的GD2.CAR-T細胞與神經(jīng)母細胞瘤CHLA255共孵育后與單純的GD2.CAR相比，可明顯增加IL-15的表達，并降低細胞分化水平，使TSCM/TCM細胞亞群占比較高(25%±11% vs 6%±2%,P<0.001)。并從轉(zhuǎn)錄水平上降低耗竭標(biāo)記PD-1以及LAG-3的表達。因此可從體內(nèi)外在無外源因子以及抗原刺激的條件下促進CAR-T增殖并延長其存活。Alizadeh的研究顯示，IL-15可通過降低mTORC1的活性使T細胞維持TSCM表型，促進細胞存活[21]。

在T細胞亞群中，盡管效應(yīng)T細胞具有較強的細胞毒作用，而低分化的TN、TSCM、TCM細胞亞群在體內(nèi)的存活時間更長，具有更佳的增殖潛力，對于CAR-T療效的持久性具有重要作用。在IL-2培養(yǎng)的條件下，T細胞的分化程度較高，盡管短時對腫瘤細胞的細胞毒作用優(yōu)于IL-7/IL-15共培養(yǎng)組，但是其作用持久性較弱。IL-7、IL-15共培養(yǎng)條件下，可減弱細胞分化，增加TSCM以及TCM細胞的比例，從而延長CAR-T在體內(nèi)生存期，對增加體內(nèi)外抗腫瘤療效具有重要意義。

2.3 提高細胞毒作用 除了促進細胞增殖及存活外，IL-15還可通過增加穿孔素及顆粒酶的產(chǎn)生、促進產(chǎn)生IFN-γ及TNF-α等因子來增加淋巴細胞的細胞毒作用。Yao等[22]從健康招募者外周血內(nèi)獲得雙陰性T細胞(DNTs)后在體外經(jīng)5 μg·mL-1anti-CD3抗體激活后培養(yǎng)15～20 d。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNTs額外用IL-15培養(yǎng)后，其可增加DNTs表面NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp44、顆粒酶B、穿孔素等表達，并促進IFN-γ及sTRAIL的分泌，從而增加體內(nèi)外DNTs對腫瘤細胞的殺傷作用。此外，有研究顯示盡管IL-7/IL-15培養(yǎng)的CAR-T細胞與淋巴瘤細胞共孵育后對體外因子釋放以及細胞毒作用與IL-2組無顯著差異，但是小鼠模型顯示，輸注IL-7/IL-15 CAR-T細胞的小鼠抗腫瘤作用更強，并且小鼠的存活期更久[16]。因此相較于IL-2組，聯(lián)合IL-7、IL-15共培養(yǎng)的CAR-T細胞作用效果更佳。

3 IL-7及IL-15的臨床應(yīng)用

關(guān)于IL-7/IL-15的臨床應(yīng)用主要涉及兩個方面，一方面是在體外培養(yǎng)CAR-T的過程中外加IL-7及IL-15來考察CAR-T的療效；另一方面即在CAR設(shè)計過程中，直接將IL-7或IL-15與CAR的基因連接，形成一個嵌合抗原受體后來評估其療效。在重慶新橋醫(yī)院開展的一項臨床試驗通過IL-7/IL-15體外培養(yǎng)來替換原來的IL-2培養(yǎng)，旨在判斷輸注淋巴瘤患者后，IL-7/IL-15培養(yǎng)的抗CD19 CAR-T細胞是否能在體內(nèi)持續(xù)更長的時間，以及CAR-T細胞的持久性是否可以提高抗淋巴瘤的療效。錢文斌等通過2A肽段將IL-7以及趨化因子CCL19與CD19.CAR構(gòu)建成新的嵌合抗原受體，用于治療B細胞淋巴瘤。同樣的，在溫州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院開展的一項臨床實驗也利用四代CAR (含IL-7/CCL19/IL-21)用于治療Nectin-4/FAP高表達的實體瘤。一項關(guān)于 iC9.GD2.CAR.IL-15 T細胞治療復(fù)發(fā)/難治性神經(jīng)母細胞瘤的Ⅰ期臨床試驗也正在北卡萊茵伯格綜合癌癥中心展開。

通過表1所示這些臨床試驗，根據(jù)患者輸注后的應(yīng)答情況可以直觀的考察IL-7/IL-15與CAR-T聯(lián)用后，CAR-T免疫療法的療效是否得到顯著提升，從而更好地為患者帶來福音。

表1 IL-7/IL-15在CAR-T免疫療法中的臨床應(yīng)用

4 結(jié)語

迄今為止，CAR-T療法在腫瘤治療領(lǐng)域方興未艾，截至目前共有429項涉及不同種類腫瘤、不同靶點的CAR-T臨床項目在全球展開，我國多家醫(yī)療企業(yè)、機構(gòu)也在開展多項針對不同腫瘤的CAR-T臨床試驗，而IL-7及IL-15因子已顯示出對CAR-T優(yōu)異的促增殖作用，可使CAR-T減弱分化表型，延長體內(nèi)存活，增加其療效。在體外培養(yǎng)過程中將IL-7/IL-15替代IL-2；或與IL-2連用；或者在CAR的設(shè)計過程中加入IL-7/IL-15基因均有利于CAR-T療效。然而IL-7及IL-15因子對CAR-T療法的療效針對患者而言具體有多大的提升作用還需要臨床試驗數(shù)據(jù)來進一步支撐。