賈子璇，冉安琪，劉季善，李 楊，王中江，江連洲,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.山東萬(wàn)得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，山東 東營(yíng) 257000）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）作為一種優(yōu)質(zhì)的植物源蛋白，因其具備良好的功能性質(zhì)及低成本等優(yōu)點(diǎn)，常作為添加劑廣泛應(yīng)用于肉制品加工中[1]，加入SPI使其與肉中的肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）發(fā)生交互作用，受熱形成復(fù)合凝膠。目前，有研究證實(shí)天然SPI與肉糜制品的混合會(huì)降低肉糜制品的凝膠性[2]。這是由于在香腸加工過(guò)程中，加熱溫度一般為72 ℃左右，此時(shí)，天然SPI中的7S與11S蛋白并未達(dá)到變性溫度，而MP的變性溫度在67～72 ℃左右，因此MP先發(fā)生變性并開(kāi)始形成凝膠，此過(guò)程會(huì)吸收肌肉中的水分，從而造成混合凝膠彈性較差且結(jié)構(gòu)疏松。Feng等[3]研究證實(shí)了大豆蛋白中β-伴大豆球蛋白會(huì)對(duì)肌肉中肌球蛋白重鏈的自聚集產(chǎn)生阻礙作用。由此可見(jiàn)，對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性處理尤為重要，從而改善其在肉制品中的功能性，生產(chǎn)出適用于工業(yè)加工且滿足消費(fèi)者需求的專用大豆蛋白系列產(chǎn)品[4]。

SPI的改性有多種方法，如酶解改性[1]、超聲波改性[5]等，Nordqvist等[6]研究發(fā)現(xiàn)堿改性可以增強(qiáng)SPI的黏度，經(jīng)改性后可得到高黏度的膠黏劑。此外，有研究表明在大豆蛋白的分子上引入有機(jī)大分子糖類物質(zhì)，使之糖基化生成新的糖蛋白，可以提高大豆蛋白的溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性等性質(zhì)[7]。實(shí)驗(yàn)室提取SPI是采用堿溶酸沉的方法從豆粕中提取且進(jìn)行凍干貯藏[8]，而本實(shí)驗(yàn)采用工業(yè)生產(chǎn)流程，堿溶條件與實(shí)驗(yàn)室制法有差異，堿性環(huán)境的改變會(huì)影響SPI的黏度[9]，且所得濃縮液采用噴霧干燥的方式進(jìn)行包裝貯藏，因此與實(shí)驗(yàn)室改性方式所得結(jié)果相比有所差異。

本實(shí)驗(yàn)考察4 種適用于工業(yè)生產(chǎn)的SPI改性方法（工業(yè)熱改性、工業(yè)堿改性、工業(yè)糖基化改性、工業(yè)氧化改性），通過(guò)測(cè)定改性SPI的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜、拉曼圖譜、游離巰基及二硫鍵含量檢測(cè)其結(jié)構(gòu)、功能的變化，并對(duì)改性SPI與MP制成的復(fù)合凝膠進(jìn)行質(zhì)構(gòu)、掃描電鏡等檢測(cè)，研究改性處理對(duì)復(fù)合凝膠的作用效果，為工業(yè)改性SPI的生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行推廣，對(duì)提高肉制品的感官及凝膠特性提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬里脊肉 市購(gòu)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鎂、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、SDS（均為分析純） 美國(guó)Sigma公司。

低溫豆粕（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%）、SPI、工業(yè)熱改性大豆分離蛋白（heated-soybean protein isolate，H-SPI）、工業(yè)堿改性大豆分離蛋白（alkaline-soybean protein isolate，A-SPI）、工業(yè)糖基化改性大豆分離蛋白（glycosylated-soybean protein isolate，G-SPI）、工業(yè)氧化改性大豆分離蛋白（oxydic-soybean protein isolate，O-SPI）（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)92%） 山東萬(wàn)得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra Turrax T25 BASIS速勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；CTK150R型離心機(jī) 長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；K-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)Stable Micro System公司；pHS-3D pH計(jì) 上海雷磁公司；PE Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀 美國(guó)PE公司；Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；SU8020掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 工業(yè)改性SPI結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的測(cè)定

1.3.1.1 SPI的生產(chǎn)與改性處理

1）SPI的工業(yè)生產(chǎn)流程

2）主要流程操作參數(shù)

堿萃：將脫脂豆粕粉粹后置于萃取罐中按料液比1∶9（g/mL）加入水，水溫控制為40 ℃，加入氫氧化鈉堿液使豆粕在pH值為7.5的條件下溶解于水中；酸沉：利用大豆蛋白等電點(diǎn)為4.2～4.5的原理，加入鹽酸調(diào)整酸沉罐中混合豆乳的pH值到4.5左右，使蛋白在此條件下產(chǎn)生沉淀；解碎：按1∶4（g/mL）的比例將蛋白凝膠加水入暫存罐中攪拌；中和樣液：在中和罐中加堿，將樣液pH值調(diào)整到7.3；蒸汽滅菌：將樣液利用140 ℃的高溫進(jìn)行瞬時(shí)殺菌；閃蒸脫水：瞬時(shí)加熱真空閃蒸，蒸餾除去豆腥味并提高凝膠性和持油性。溫度控制在72 ℃，殺菌時(shí)間為5～15 s。

3）SPI的工業(yè)改性處理

H-SPI：上述閃蒸脫水步驟中的閃蒸溫度由72 ℃調(diào)整為81 ℃，其他參數(shù)不變；A-SPI：上述中和樣液過(guò)程的pH值由7.3調(diào)至8.7，其他參數(shù)不變；G-SPI：上述調(diào)配過(guò)程中添加1%魔芋淀粉，加溫?cái)嚢柚?5 ℃，持續(xù)90 min，其他參數(shù)不變；O-SPI：將制備的SPI置于45 ℃貯藏倉(cāng)保溫36 h進(jìn)行氧化，其他參數(shù)不變。

本實(shí)驗(yàn)中4 種工業(yè)改性方式是經(jīng)過(guò)工業(yè)上反復(fù)實(shí)驗(yàn)及篩選確定的，是已經(jīng)在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的蛋白，故所選參數(shù)均為已優(yōu)化后的參數(shù)。

1.3.1.2 SDS-PAGE測(cè)定

參照Laemmli[10]的方法，稍作修改。使用的分離膠及濃縮膠分別為15%和5%。將蛋白樣品溶于樣品緩沖液中，蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL，95 ℃加熱5 min后取10 μL上樣，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳完成后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，采用體積分?jǐn)?shù)10%冰乙酸溶液和體積分?jǐn)?shù)10%甲醇溶液脫色，脫色后電泳膠片用Tanon凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.1.3 拉曼光譜分析

測(cè)定條件：將SPI樣品分散在緩沖液中并配制成100 mg/mL溶液進(jìn)行拉曼測(cè)定，拉曼光譜的激發(fā)光波長(zhǎng)為785 nm，發(fā)射功率為300 mW，測(cè)量拉曼光譜范圍選取600～1 800 cm-1。每個(gè)樣品重復(fù)掃描3 次，各樣品的拉曼譜圖均由計(jì)算機(jī)作信號(hào)累加后平均，并繪圖輸出，峰位誤差小于±3 cm-1。

圖譜的處理：首先進(jìn)行拉曼圖譜基線校正、各峰歸屬采用OMINIC軟件，歸一化處理以苯丙氨酸的1 004 cm-1作為內(nèi)標(biāo)，并且以此作為各拉曼峰強(qiáng)度變化的依據(jù)，譜圖的擬合利用Origin 8.5軟件[11]。

1.3.1.4 巰基與二硫鍵含量的測(cè)定

游離巰基含量的測(cè)定：參考Beveridge等[12]的方法，稍作修改。將一定量SPI溶于pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，25 ℃磁力攪拌1 h，得到質(zhì)量濃度為7.5 mg/mL的SPI溶液。取2 mL SPI溶液加入2 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液和67 μL 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，置于25 ℃恒溫水浴鍋中靜置1 h直至反應(yīng)充分，10 000 r/min離心30 min，取上清液在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度A412nm。每組樣品測(cè)定3 次。

總巰基含量的測(cè)定：取400 μL SPI溶于10 mL離心管中，加入20 μL巰基乙醇和1.6 mL尿素-鹽酸胍溶液，于25 ℃恒溫水浴鍋中靜置1 h直至充分反應(yīng)，5 000 r/min離心10 min，清洗沉淀2 次。向沉淀中加入4 mL pH 7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和32 μL 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)。置于25 ℃恒溫水浴鍋中靜置1 h直至反應(yīng)充分，10 000 r/min離心30 min。取上清液在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度A412nm。每組樣品測(cè)定3 次。

巰基含量按式（1）計(jì)算：

式中：13 600為摩爾消光系數(shù)/（L/（molgcm））；ρ為蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

二硫鍵含量按式（2）計(jì)算：

1.3.2 改性SPI與MP復(fù)合凝膠性質(zhì)測(cè)定

1.3.2.1 MP的提取

根據(jù)Feng Xiaochao[13]和Park[14]等的方法并稍加修改提取MP。在市場(chǎng)購(gòu)買新鮮的豬背肌，剔除多余的筋膜、脂肪，用絞肉機(jī)攪碎，所得肉糜用于提取豬肉MP。稱取50 g肉樣，加4 倍體積的pH 7.0緩沖液（0.1 mol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Na2HPO4）勻漿離心，棄上清液，取沉淀重復(fù)上述步驟3遍。所得沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液，勻漿離心，沉淀重復(fù)洗滌2 次，第3次加洗液勻漿后，用四層紗布過(guò)濾除去結(jié)締組織，最后用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至6.25后離心去上清液，所得膏狀物為MP。MP濃度采用雙縮脲法測(cè)定，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 復(fù)合凝膠的制備

提取的MP（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為8%）稀釋到40 mg/mL，用蒸餾水將SPI配成40 mg/mL溶液，SPI與MP按1∶4比例混合均勻[15]，所有混合溶液的總蛋白質(zhì)量濃度均為40 mg/mL。取20 mL攪勻的溶液于80 ℃水浴鍋中加熱30 min，取出迅速置于冰水中冷卻，4 ℃冰箱中貯藏12 h。制備好的凝膠每次測(cè)定前在室溫（20～25 ℃）平衡30 min，然后用于測(cè)定質(zhì)構(gòu)及掃描電鏡。

1.3.2.3 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

根據(jù)Buamard等[16]的方法進(jìn)行凝膠質(zhì)構(gòu)的測(cè)定。測(cè)試時(shí)將樣品固定于測(cè)定平臺(tái)，探頭型號(hào)選擇P/0.5（直徑12 mm），下壓得到的穿透力即為蛋白的凝膠強(qiáng)度。選用的物性儀測(cè)定參數(shù)如下：測(cè)試前速率3.0 mm/s；測(cè)試速率0.3 mm/s；觸發(fā)力5 g；測(cè)試后速率3.0 mm/s；穿刺距離10.0 mm。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.2.4 掃描電鏡測(cè)定

將凝膠切成1 cm3（1 cmh1 cmh1 cm）的小方塊，放于孔板中，加入2.5%戊二醛溶液固定2 h，然后用磷酸緩沖液漂洗數(shù)次，接著用乙醇脫水。用醋酸戊酯置換乙醇同時(shí)干燥。用銀粉導(dǎo)電膠固定樣品，在鍍膜機(jī)內(nèi)鍍金屬膜，最后在掃描電鏡下觀察和拍照，加速電壓為10 kV，每個(gè)樣品觀察8 個(gè)區(qū)域。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 個(gè)平行樣的平均值，用Origin 8.5和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析（ANOVA），用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性處理對(duì)SPI亞基組成的影響

圖1 改性SPI的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE results of different modified SPIs

如圖1所示，從總體亞基組成看，4 種工業(yè)改性SPI分離膠的電泳條帶與對(duì)照SPI相比無(wú)顯著差異，由此可以看出工業(yè)改性處理并未對(duì)蛋白的亞基組成造成顯著影響。與對(duì)照SPI相比，H-SPI的11S堿性亞基（B亞基）條帶變淺，這可能是由于11S球蛋白受熱變性發(fā)生解離后復(fù)聚集，從而導(dǎo)致11S球蛋白中堿性亞基生成不溶性聚集體[17]。工業(yè)堿改性與工業(yè)糖基化改性SPI的分離膠條帶基本一致，與對(duì)照SPI相比，A-SPI和G-SPI的條帶在分子質(zhì)量為20 kDa處出現(xiàn)了加深，并出現(xiàn)了分子質(zhì)量為5～17 kDa的小分子條帶，推測(cè)可能是改性處理使SPI分子亞基解離，出現(xiàn)了分子質(zhì)量為5～17 kDa的低分子亞基，且部分亞基聚合形成了分子質(zhì)量為20 kDa的小分子聚集體[18]。O-SPI與對(duì)照SPI相比，亞基條帶的顏色加深，凝膠槽口處高分子聚集體的積聚逐漸加深，表明蛋白受氧化而產(chǎn)生聚集[19]。

2.2 工業(yè)改性處理對(duì)SPI結(jié)構(gòu)影響的拉曼光譜分析

2.2.1 工業(yè)改性處理對(duì)SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖2 工業(yè)改性SPI的拉曼光譜圖Fig. 2 Raman spectra of different industrial modified SPIs

如圖2所示，1 600～1 700 cm-1范圍內(nèi)是二級(jí)結(jié)構(gòu)特征譜帶。本實(shí)驗(yàn)利用酰胺I帶擬合SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)，酰胺I帶的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰范圍為1 645～1 660 cm-1為α-螺旋；1 665～1 680 cm-1為β-折疊；1 680～1 690 cm-1為β-轉(zhuǎn)角；1 660～1 670 cm-1為無(wú)規(guī)卷曲[11,20]。本實(shí)驗(yàn)中SPI的拉曼圖譜二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量計(jì)算由Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件完成。

表1 利用酰胺I帶擬合SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果Table 1 Proportions of secondary structures in SPI estimated by amide I band fi tting

由表1可知，4 種工業(yè)改性處理均減少了SPI的α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量，并增加了β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。本團(tuán)隊(duì)前期研究報(bào)道了與未經(jīng)熱處理的SPI相比，熱處理30 min增加了SPI的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量，降低了β-折疊結(jié)構(gòu)含量[21]。本實(shí)驗(yàn)中工業(yè)熱改性是在81 ℃的閃蒸溫度下短時(shí)加熱，由此推測(cè)工業(yè)熱改性與實(shí)驗(yàn)室熱改性之間的差異會(huì)造成SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同轉(zhuǎn)變。耿蕊[22]研究表明堿改性會(huì)降低SPI的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量，暴露出更多的疏水基團(tuán)。布冠好等[23]報(bào)道了SPI經(jīng)糖基化后，復(fù)合蛋白質(zhì)的α-螺旋含量降低，β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加。SPI經(jīng)氧化后，α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲含量下降，β結(jié)構(gòu)含量上升；盧巖[24]研究證實(shí)了SPI氧化過(guò)程中伴隨著α-螺旋結(jié)構(gòu)的損失。

2.2.2 改性處理對(duì)SPI二硫鍵構(gòu)型的影響

圖2中500～550 cm-1范圍內(nèi)是拉曼光譜二硫鍵特征譜帶，其中二硫鍵gauche-gauche-gauche（g-g-g）振動(dòng)模式歸屬于500～510 cm-1，gauche-gauche-trans（g-g-t）形式二硫鍵在515～525 cm-1處，trans-gauche-trans（t-g-t）形式二硫鍵在535～545 cm-1處[11,25]。采用了Origin 8.5軟件進(jìn)行多峰值擬合研究不同工業(yè)改性處理對(duì)于SPI二硫鍵變化的影響。

表2 工業(yè)改性對(duì)SPI二硫鍵構(gòu)型的影響Table 2 Effects of different industrial modi fi cations on the S—S bond conformations of SPI

由表2可知，g-g-g構(gòu)型代表分子內(nèi)二硫鍵，t-g-t構(gòu)型代表分子間二硫鍵。未經(jīng)處理的SPI主要以g-g-g構(gòu)型為主，相對(duì)含量為44.32%，這與Przulj等[26]發(fā)現(xiàn)的天然SPI中g(shù)-g-g構(gòu)型二硫鍵所占比例一致。H-SPI的g-g-g構(gòu)型相對(duì)含量下降，t-g-t相對(duì)含量增加，由此看出工業(yè)熱改性使SPI的分子內(nèi)二硫鍵轉(zhuǎn)化為分子間二硫鍵，Ellepola等[27]對(duì)大米球蛋白二硫鍵構(gòu)型的研究表明熱處理能夠促進(jìn)蛋白分子間二硫鍵的形成。A-SPI的g-g-g構(gòu)型二硫鍵所占比例與對(duì)照SPI相比無(wú)顯著變化（P＞0.05），g-g-t構(gòu)型相對(duì)含量下降，t-g-t構(gòu)型相對(duì)含量增加，這與本團(tuán)隊(duì)前期研究pH 8.0條件下SPI二硫鍵的3 種構(gòu)型含量所占比例一致[11]。與對(duì)照SPI相比，G-SPI的g-g-g構(gòu)型和t-g-t構(gòu)型相對(duì)含量增加，g-g-t含量減少。張瑤[28]研究證明了糖化處理SPI后，二硫鍵由g-g-t轉(zhuǎn)變?yōu)閠-g-t構(gòu)象。工業(yè)氧化改性使SPI二硫鍵構(gòu)型由分子間轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)二硫鍵，吳偉[29]的研究表明這可能與分子間二硫鍵被氧化有關(guān)。

2.2.3 改性處理對(duì)SPI氨基酸側(cè)鏈的影響

2.2.3.1 酪氨酸殘基的變化

圖2拉曼光譜的850 cm-1和830 cm-1處是酪氨酸殘基的苯環(huán)呼吸振動(dòng)和面外彎曲倍頻之間的費(fèi)米共振[11,27]，利用這2 條譜線的強(qiáng)度比（I850/I830），可以確定蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基的暴露與埋藏的程度。當(dāng)I850/I830的比值在1.25～1.40時(shí)，表明酪氨酸殘基完全暴露于分子表面；當(dāng)比值為0.3～0.5時(shí)，酪氨酸殘基完全埋藏于分子內(nèi)部；當(dāng)比值為0.7時(shí)，酪氨酸殘基為電離狀態(tài)。

表3 工業(yè)改性SPI的酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830及色氨酸殘基分析結(jié)果Table 3 I850/I830 and tryptophan band intensity of different industrial modified SPIs

由表3可知，不同工業(yè)改性SPI的I850/I830比值均在1.00～1.03之間，接近于1.25～1.40范圍，表明酪氨酸殘基趨向于“暴露式”。與對(duì)照組相比，H-SPI的酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830比值變化不顯著（P＞0.05）。齊寶坤等[30]研究表明在80 ℃熱處理過(guò)程中酪氨酸殘基微環(huán)境可以保持；工業(yè)堿改性顯著增加了SPI酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830比值（P＜0.05），說(shuō)明堿改性可使SPI的酪氨酸殘基更多地暴露于分子表面，并作為氫鍵的供體或受體與水相互作用[11]；G-SPI樣品表現(xiàn)為“暴露”式。張瑤[28]研究表明與天然SPI相比，糖基化后的大豆蛋白-葡聚糖復(fù)合體系中有更多的酪氨酸暴露到溶液的極性微環(huán)境中；O-SPI的酪氨酸殘基暴露程度增大，說(shuō)明氧化處理破壞了維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，使包埋于SPI分子內(nèi)部的酪氨酸殘基暴露于分子表面[24]。

2.2.3.2 色氨酸殘基的變化

圖2中760 cm-1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸殘基。Li-Chan[31]研究表明760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)度與色氨酸殘基的“包埋”和“暴露”態(tài)有關(guān)。I760越大，色氨酸殘基微環(huán)境極性越強(qiáng)，導(dǎo)致色氨酸殘基由埋藏在分子內(nèi)部向分子表面暴露。

由表3可知，與對(duì)照SPI相比，H-SPI在760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)度升高，齊寶坤等[30]認(rèn)為熱處理使SPI色氨酸殘基暴露是由于蛋白質(zhì)發(fā)生變性，分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)導(dǎo)致的；A-SPI色氨酸殘基的暴露程度增大，本團(tuán)隊(duì)前期研究認(rèn)為堿改性使SPI埋藏在疏水環(huán)境中的色氨酸殘基暴露到分子的表面[11]；G-SPI色氨酸殘基趨向于“暴露”態(tài)，張瑤[28]研究認(rèn)為色氨酸殘基最先是包埋的、疏水的，而后轉(zhuǎn)變?yōu)楸┞兜恼归_(kāi)形式；O-SPI的色氨酸譜帶強(qiáng)度降低，Traverso[32]認(rèn)為這是由于氧化引起蛋白聚集，導(dǎo)致天然SPI先前暴露的色氨酸殘基被包埋在改性后的SPI分子內(nèi)部[33]。

2.3 改性處理對(duì)SPI巰基及二硫鍵含量的影響

由圖3可知，工業(yè)熱改性處理顯著降低了SPI的游離巰基含量，增加了總巰基含量，結(jié)合表2二硫鍵構(gòu)型結(jié)果可知，工業(yè)熱改性顯著提高了SPI的分子間二硫鍵含量（P＜0.05）。楊嵐等[34]研究認(rèn)為這可能是因?yàn)闇囟仍礁撸肿舆\(yùn)動(dòng)速率和碰撞幾率越大，同時(shí)在較短時(shí)間內(nèi)能夠相互反應(yīng)的基團(tuán)暴露的越多，因此分子間巰基相互作用形成的二硫鍵越多，游離巰基含量越少。工業(yè)堿改性處理顯著提高了SPI的總巰基含量（P＜0.05），游離巰基含量與對(duì)照SPI相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），結(jié)合表2可知堿改性提高了SPI分子間二硫鍵含量。堿性環(huán)境會(huì)加速巰基氧化[35]。蔣將[36]研究在pH值調(diào)至12.0后，表面巰基含量有降低趨勢(shì)，這可能是由于巰基氧化和二硫鍵的形成所致。由圖3結(jié)合表2可知，糖基化處理可能使SPI游離的表面巰基形成了更多的分子內(nèi)及分子間二硫鍵。張瑤[28]研究證實(shí)糖化處理可減少SPI游離巰基含量且增加二硫鍵含量。O-SPI的游離巰基和二硫鍵含量顯著降低（P＜0.05），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI中游離巰基可能會(huì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致游離巰基含量減少[29]。Thomas等[37]認(rèn)為大豆蛋白巰基被氧化成為不可逆氧化狀態(tài)，形成了非二硫鍵的含硫化合物。

圖3 工業(yè)改性方式對(duì)SPI游離巰基及總巰基含量的影響Fig. 3 Effect of different industrial modification methods on free sulfhydryl group and total sulfhydryl group contents of SPI

2.4 SPI-MP復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)分析

表4 SPI-MP復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)結(jié)果Table 4 Texture characteristics of SPI-MP hybrid gels

如表4所示，H-SPI、A-SPI、G-SPI與MP形成的混合凝膠硬度、彈性、黏結(jié)性、膠著性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性均顯著優(yōu)于對(duì)照SPI（P＜0.05），O-SPI形成的混合凝膠除黏結(jié)性外，其余各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)特性都差于對(duì)照SPI。程春梅[38]報(bào)道了SPI在肉制品中的應(yīng)用，認(rèn)為加熱后的SPI會(huì)使其蛋白分子從天然狀態(tài)解折疊，亞基解離并形成部分的可溶性聚集體，從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子內(nèi)及與水分子間的相互作用。Jiang Jiang等[39]研究證實(shí)對(duì)SPI進(jìn)行堿處理會(huì)顯著增強(qiáng)MP凝膠能力，這可能是由于堿改性使SPI分子展開(kāi)，增加了與MP之間的交聯(lián)作用[40]。G-SPI與MP復(fù)合凝膠的綜合質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于對(duì)照SPI，這是由于SPI經(jīng)糖基化改性后引入了糖鏈，分子運(yùn)動(dòng)阻力和黏度增加，同時(shí)反應(yīng)后蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)暴露，有利于與MP的相互作用[41]。吳偉[29]研究認(rèn)為隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生降解，黏度降低，減弱了SPI與MP之間的交聯(lián)作用。

2.5 凝膠掃描電鏡分析

圖4 復(fù)合凝膠掃描電鏡結(jié)果（×1 000）Fig. 4 Scanning electron micrographs of hybrid gels (× 1 000)

如圖4所示，與對(duì)照組相比，工業(yè)熱改性、工業(yè)堿改性和工業(yè)糖基化改性處理均使復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)更加致密，工業(yè)氧化改性則使復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)更加松散且無(wú)規(guī)則。H-SPI-MP凝膠表面不規(guī)則空洞減少，張海瑞等[42]研究發(fā)現(xiàn)在90 ℃加熱條件下，SPI的凝膠結(jié)構(gòu)更加致密；A-SPIMP凝膠表面結(jié)構(gòu)致密，凝膠界面網(wǎng)絡(luò)更加清晰。連喜軍等[43]研究表明pH 8～11，隨著pH值升高，SPI形成凝膠的透明性增加；G-SPI-MP凝膠表面比較規(guī)則，蛋白質(zhì)交聯(lián)程度大。Lakemond等[44]研究發(fā)現(xiàn)糖基化改性增加了長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷曰鶊F(tuán)的含量，增強(qiáng)疏水相互作用，從而維持凝膠的均一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；O-SPI-MP凝膠表面存在大量無(wú)規(guī)則孔隙，這與吳偉[29]研究結(jié)果一致，隨著蛋白氧化程度的增加，大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的粗糙度增加，內(nèi)部孔隙變大并且分布不均勻。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)SPI亞基組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二硫鍵構(gòu)型、巰基含量、氨基酸側(cè)鏈分析及SPI-MP復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)特性、掃描電鏡結(jié)果可知：4 種工業(yè)改性未對(duì)SPI亞基組成產(chǎn)生顯著影響，但是均減少了SPI的α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量，并增加了β-折疊與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量；工業(yè)熱改性、工業(yè)堿改性、工業(yè)糖基化改性顯著增加了SPI二硫鍵含量，而工業(yè)氧化改性則顯著降低了SPI的二硫鍵含量（P＜0.05）；氨基酸側(cè)鏈分析結(jié)果表明4 種工業(yè)改性蛋白的酪氨酸殘基均趨向于“暴露式”，工業(yè)熱改性、工業(yè)堿改性、工業(yè)糖基化改性均使色氨酸殘基暴露程度增大，而工業(yè)氧化改性導(dǎo)致氧化蛋白聚集使色氨酸殘基被包埋；質(zhì)構(gòu)特性及掃描電鏡結(jié)果表明，工業(yè)熱改性、工業(yè)堿改性、工業(yè)糖基化改性均顯著提高了SPI-MP復(fù)合凝膠的硬度、彈性等質(zhì)構(gòu)特性（P＜0.05），復(fù)合凝膠更加致密均勻，而工業(yè)氧化改性SPI與MP形成的復(fù)合凝膠粗糙多孔。綜上，在肉制品生產(chǎn)中，可以對(duì)SPI進(jìn)行工業(yè)熱改性、工業(yè)堿改性、工業(yè)糖基化改性等方式，作為添加劑填充至肉制品中，提高肉制品的感官及凝膠特性。