彭新顏，劉 媛，賀紅軍，張 敏，邵凌健，曾玉龍，王曉雨

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學(xué)生物納米技術(shù)研究院，山東 煙臺 264025；3.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005）

冷凍貯藏是國內(nèi)外調(diào)節(jié)肉制品市場最普遍且有效的手段[1]。然而在實際貯藏、生產(chǎn)和銷售過程中，由于冷鏈的缺失，使得冷藏肉不可避免的反復(fù)經(jīng)歷冷凍-解凍（反復(fù)凍融）過程[2-3]。反復(fù)凍融循環(huán)會導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，引發(fā)肉產(chǎn)品中蛋白質(zhì)、脂肪、肌纖維發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，如丙二醛和羰基衍生物含量增加，巰基含量減小，肌球蛋白和肌動蛋白發(fā)生輕微變性[1]，從而引起肉制品汁液流失、功能品質(zhì)下降和營養(yǎng)物質(zhì)損失等問題，由此造成的肉品質(zhì)劣變已成為肉品學(xué)科廣泛關(guān)注的焦點[1,3-4]。據(jù)統(tǒng)計，我國冷凍肉制品汁液流失率高達(dá)8%～10%，每年造成肉品行業(yè)經(jīng)濟損失已超過450億 元[4]。特別是近幾年需求量逐漸增大的肉丸、肉餅、肉排、肉腸等調(diào)理肉制品所需的肉糜原料，由于反復(fù)凍融給企業(yè)造成的損失已受到業(yè)界的高度重視。因此，如何防止貯藏過程中肉制品的氧化和改善產(chǎn)品品質(zhì)已經(jīng)成為肉制品行業(yè)中亟待解決的重要問題[5-6]。

近年來，隨著人們對合成抗氧化劑潛在危害的關(guān)注，利用不同蛋白資源開發(fā)天然抗氧化多肽已成為近年來的廣泛關(guān)注焦點[7]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)水解物可以與肉體系中蛋白發(fā)生共價或非共價結(jié)合，起到防止肉蛋白氧化的作用[8-10]。如Wang等[8]證實，土豆水解多肽能降低豬肉硫代巴比妥酸值（thiobarbituricacid reactive substances，TBARS）和蛋白的羰基含量，對豬肉脂肪和蛋白的氧化具有明顯的抑制作用[9]；Li Yanqing等[10]研究表明，在凍藏過程中添加乳清多肽（whey protein hydrolysates，WPH）可以有效抑制魚糜肌原纖維蛋白氧化的發(fā)生。研究者將玉米蛋白、豬皮膠原蛋白、豌豆蛋白和麥胚蛋白的水解物添加到貯藏的肉糜中發(fā)現(xiàn)，添加多肽的處理組能顯著降低樣品的TBARS值、過氧化物值、高鐵肌紅蛋白含量及增加肉糜的紅度值（a*）[11]。豬肉糜中添加大豆多肽后，所形成的凝膠緊密均勻、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)好，對蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)也具有保護(hù)作用[12]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，將WPH添加到豬肉糜中，能夠抑制冷藏豬肉糜羰基含量升高以及巰基的降低速率，改善冷藏時豬肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的劣變，保護(hù)肉蛋白的凝膠質(zhì)構(gòu)[13]。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，以豬肉糜為研究對象，繼續(xù)研究WPH對反復(fù)凍融肉糜的保護(hù)作用，主要以解凍損失、肉蛋白質(zhì)構(gòu)、羰基含量、流變學(xué)特性等為指標(biāo)，探討WPH對反復(fù)凍融肉糜品質(zhì)變化的影響，以期為調(diào)理肉的冷凍加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（屠宰后5 h以內(nèi)的新鮮脊背肉）購于山東煙臺大潤發(fā)超市；乳清蛋白（蛋白含量約為95%）MilkyWay商業(yè)公司；堿性蛋白酶（6h104U/g）丹麥Novo公司；丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA） 美國Sigma公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-E離心機 美國Beckman Coulter公司；Ultra Turrax T-25 Basic高速勻漿機 德國IKA公司；TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；M2e多功能酶標(biāo)儀 美國MD公司；MCR 301流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；Evolution激光顯微共聚拉曼光譜儀法國HORIBA公司；絞肉機 山東嘉信食品機械公司；AL-104精密電子天平 梅特勒-托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPH的制備

參考Peng Xinyan等[13]的方法并稍作改動，將乳清蛋白配制成5%的溶液，經(jīng)95 ℃預(yù)熱5 min，降溫到65 ℃后加入堿性蛋白酶（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%），通過不斷加入1 mol/L的NaOH溶液，使pH值保持在8.5，水解5 h后沸水浴5 min滅酶，將得到的乳清水解物經(jīng)1 ku的超濾膜分離，收集透過1 ku膜的WPH部分，凍干后用于后續(xù)實驗。

1.3.2 豬肉糜肉餅的制備

豬肉糜的制備在4 ℃冷庫中進(jìn)行，取宰后脊背肉3 000 g，去除表面筋膜和多余的脂肪，切成小肉塊后絞碎。實驗分為6 組，每份食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，第1組為空白組，第2組添加10%未水解乳清蛋白（native whey protein，NWP），3、4、5組分別加入5%、10%、15%的WPH，最后一組添加0.02%的BHA作陽性對照。制成肉餅（約6.5 cmh1.5 cm），2 個放入一個CT盒中，保鮮膜封好，置于-18 ℃冷凍8～12 h，然后在恒溫條件下（（21f0.5）℃）將豬肉糜餅自然解凍至中心溫度為0 ℃。解凍完成后重新放回-18 ℃冰箱中冷凍貯存，每5 d記作一個循環(huán)，分別做0、1、3、5、7、9 次凍融循環(huán)處理后測定指標(biāo)。

1.3.3 豬肉糜肌原纖維蛋白的提取與測定

參考劉旺等[14]方法并適當(dāng)?shù)男薷模麄€過程在4 ℃冷庫完成。將攪碎肉糜加入5 倍體積的提取緩沖液（20 mmol/L的KH2PO4/K2HPO4、1 mmol/L EGTA、0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2，pH 7.0）冰浴勻漿30 s，4 ℃、2 500hg離心10 min，用4 層紗布進(jìn)行過濾。棄去上清液，重復(fù)4 次，其中第2次提取液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100。最后將提取的肌原纖維蛋白膏體保存于冰盒中待測，蛋白的質(zhì)量濃度用雙縮脲法進(jìn)行測定。

1.3.4 肌原纖維蛋白凝膠的制備

將提取的肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖液配制成40 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液，然后量取20 mL于100 mL離心管中，在20 ℃的上升水浴鍋中加熱至70 ℃后進(jìn)行保溫20 min，結(jié)束后迅速用冰塊冷卻，最后保存在4 ℃冷庫中平衡過夜后待測。

1.3.5 解凍損失的測定

參考Filgueras等[15]的方法略作修改，將肉糜制成75 g的肉糜餅，置于-18 ℃冷凍8～12 h，將冷凍好的肉糜餅取出后立即準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，隨后在恒溫條件下（（21f0.5）℃）解凍，讓豬肉糜餅自然解凍至中心溫度為0 ℃，解凍過程3.5 h左右。解凍完成后，用濾紙將豬肉糜餅表面滲出的水分擦凈，準(zhǔn)確稱量豬肉糜餅的質(zhì)量。解凍損失率按式（1）計算：

式中：M1為解凍前的質(zhì)量；M2為解凍后的質(zhì)量。

1.3.6 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值的測定

TVB-N值是評價肉類鮮度的最常用指標(biāo)，檢測方法按照GB/T 5009.44ü2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》進(jìn)行。

1.3.7 TBARS值的測定

參照Kim等[16]的方法，并適當(dāng)修改。取20 g搗碎豬肉糜放入試管中，加50 mL 25%的三氯乙酸溶液和40 mL蒸餾水，高速均質(zhì)后進(jìn)行離心處理，取4 mL上清液加入4 mL的TBA溶液，待沸水浴中反應(yīng)20 min結(jié)束后進(jìn)行冷卻，測定吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷作標(biāo)準(zhǔn)曲線，TBARS值按式（2）計算：

式中：A為吸光度；V為豬肉糜體積/mL；M為丙二醛摩爾質(zhì)量（72.063 g/mol）；ε為摩爾吸光系數(shù)；L為光程，1 cm；m為豬肉糜質(zhì)量/g。

1.3.8 羰基的測定

羰基含量的測定采用2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）比色法，根據(jù)Sher等[17]的方法并作適當(dāng)?shù)男薷?。?.5 mL質(zhì)量濃度為40 mg/mL的蛋白溶液放于2 個離心管中，其中1 管加入DNPH溶液，另1 管加入HCl溶液作為空白組，期間每隔10 min旋渦振蕩1 次，然后加入10%三氯乙酸停止反應(yīng)，離心后倒掉上清液，用濾紙吸干外壁并用丙酮和鹽酸（100∶3，V/V）洗滌沉淀3 次，加入2 mL濃度為6 mol/L的鹽酸胍溶液，37 ℃溶解沉淀20 min，10 000hg離心5 min，最后去除不溶性部分，在370 nm波長處測定吸光度。重復(fù)3 次后，羰基含量按式（3）計算：

式中：ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.9 動態(tài)流變的測定

參照劉旺等[14]的方法并加以修改。采用P/50型號的探頭，狹縫距離為1 mm，將豬肉糜均勻涂抹在50 mm平行板上并確保無氣泡。升溫區(qū)間設(shè)定為20～80 ℃，加熱速率2 ℃/min，測試頻率為1 Hz，應(yīng)變力為1%。為防止升溫過程中水分的蒸發(fā)，用石蠟封住平行板與空氣接觸的外沿。每樣品平行測定3 次。

1.3.10 質(zhì)構(gòu)的測定

肉糜凝膠制備：取適量豬肉糜放在10 mL小燒杯壓實，封口膜密封后置于水浴鍋中，以2 ℃/min從20 ℃升溫到80 ℃，并在80 ℃保持25 min。形成凝膠后取出冷卻，于4 ℃冷藏庫中過夜后測定指標(biāo)。應(yīng)用TPA模式對豬肉糜樣品制成的凝膠進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測試，主要對硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性進(jìn)行研究。具體參數(shù)按照Qi Jun等[18]的方法稍作修改。采用P50探頭，測試前速率2.0 mm/s，測試速率2.0 mm/s，測試后速率10.0 mm/s，壓縮程度50%，兩次測試時間間隔為3 s，數(shù)據(jù)采集速率為200 pps，觸發(fā)值為5.0 g，測定距離為25 mm，每組樣品測試平行3 次。

1.3.11 拉曼光譜的測定

參考Shao Junhua等[19]的方法對豬肉糜中肌原纖維蛋白進(jìn)行拉曼光譜測定。光譜測量采用LabRAM HR Evol激光顯微鏡共聚拉曼分析儀（配532 nm氬離子激光光源）進(jìn)行，測試所使用的功率約為100 mW，用50 倍長焦距鏡頭對樣品進(jìn)行激光聚焦。光譜獲取條件為：開孔200 μm，光柵600 g/mm，累積掃描3 次，測定時間為60 s，分辨率為2 cm-1，數(shù)據(jù)獲取速率為1 2 0/（c m gm i n）。獲取的拉曼光譜范圍在400～2 100 cm-1之間。測試完成后用Labspec軟件對拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理（平滑，多點基線校正去除熒光背景），每個樣品重復(fù)測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)3 次，結(jié)果表示為fs。利用Statistix 9.1軟件中的Linear Models程序進(jìn)行處理，進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），使用Sigmaplot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPH對反復(fù)凍融肉糜解凍損失的影響

圖1 WPH對不同凍融循環(huán)豬肉糜解凍損失的影響Fig. 1 Effect of wWPH on thawing loss during repeated freezingthawing of chopped pork

如圖1所示，豬肉解凍損失率隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加而顯著升高。在1 次凍融循環(huán)時，各組豬肉糜的解凍損失率維持在2.67%～2.93%之間，無顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)凍融循環(huán)在3～9 次時，解凍損失率持續(xù)增加，凍融9 次后解凍損失率高達(dá)7.00%～12.4%。WPH各處理組解凍損失率顯著低于空白組（P＜0.05），其中15% WPH組解凍損失最小。NWP組在第7次凍融循環(huán)時顯著優(yōu)于空白組（P＜0.05），達(dá)到WPH低、中劑量組的水平。BHA組在第5次凍融循環(huán)時，顯著優(yōu)于空白組（P＜0.05），說明WPH具有更好保水能力。

2.2 WPH對反復(fù)凍融肉糜TVB-N值的影響

圖2 WPH對不同凍融循環(huán)的豬肉糜TVB-N值的影響Fig. 2 Effect of WPH on TVB-N value during repeated freezingthawing of chopped pork

由圖2可知，各組TVB-N值隨著凍融次數(shù)不斷增加呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。凍融0 次時豬肉糜TVB-N值最低，在7.33～7.66 mg/100 g之間上下浮動，且各處理組之間并無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)凍融循環(huán)達(dá)到9 次，豬肉糜TVB-N值顯著升高到24.79～31.95 mg/100 g，說明凍融使豬肉糜產(chǎn)生了嚴(yán)重的腐敗變質(zhì)。凍融循環(huán)3 次后，10% NWP組和5%、10% WPH組無顯著性差異（P＞0.05），但與WPH高劑量組及BHA組差異顯著（P＜0.05），說明高劑量WPH有效抑制了因蛋白質(zhì)腐敗分解而造成的揮發(fā)性鹽基氮的形成。

2.3 WPH對反復(fù)凍融肉糜TBARS值的影響

圖3 WPH對不同凍融循環(huán)豬肉糜TBARS值的影響Fig. 3 Effect of WPH on TBARS value during repeated freezingthawing of chopped pork

如圖3所示，TBARS值隨凍融次數(shù)的增加而呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，從凍融0 次時的0.047～0.048 mg/kg顯著升高至0.133～0.183 mg/kg，說明豬肉糜的脂肪氧化程度顯著增加。在凍融0 次時，各處理組的TBARS值無顯著差異（P＞0.05）。在凍融1～9 次期間，10% NWP處理組、5%和10% WPH組差異不顯著（P＞0.05）。在凍融1、3、5、7 次時，15% WPH處理組TBARS值最低，與0.02% BHA陽性空白組差異不顯著（P＞0.05）。尤其當(dāng)凍融3 次時，15% WPH組抗氧化效果明顯超過0.02%BHA組。說明添加WPH能夠抑制TBARS值的上升。

2.4 WPH對反復(fù)凍融肉糜肌原纖維蛋白羰基的影響

圖4 WPH對不同凍融循環(huán)豬肉糜羰基含量的影響Fig. 4 Effect of WPH on protein carbonyl content during repeated freezing-thawing of chopped pork

圖4 反映了WPH對不同凍融循環(huán)處理后的肌原纖維蛋白羰基含量的變化。未凍融前，各組分含量與空白組分無顯著性差異（P＞0.05）；隨凍融次數(shù)的增加，豬肉糜肌原纖維蛋白氧化時間增加，羰基含量也呈現(xiàn)顯著的上升趨勢（P＜0.05）。如9 次凍融循環(huán)后，空白組的羰基含量從0 次凍融的0.76 nmol/mg增加到6.98 nmol/mg。3 次凍融處理后，10% NWP組、5%和10% WPH組之間無顯著差異（P＞0.05），而15% WPH高劑量組以及0.02%BHA組的蛋白羰基含量顯著優(yōu)于未水解組和5% WPH低劑量組。從凍融1 次循環(huán)開始，15% WPH組羰基含量與0.02% BHA組無顯著差異（P＞0.05），對肌原纖維蛋白羰基含量的抑制效果最好。

2.5 WPH對反復(fù)凍融肉糜流變性的影響

圖5 WPH對不同凍融循環(huán)豬肉糜模量損耗G’’的影響Fig. 5 Effect of WPH on G’’ during repeated freezing-thawing of chopped pork

如圖5A所示，在低溫時，各處理組的模量損耗G’’相似，差別不明顯。G’’值隨著凍融循環(huán)的增加開始出現(xiàn)差異，溫度越高差異越顯著。在整個升溫區(qū)間，都有G’’相對最大值出現(xiàn)。由圖5可知，豬肉糜G’’值隨著凍融循環(huán)的增加而呈現(xiàn)明顯降低趨勢。在同一凍融次數(shù)下，15% WPH組與0.02% BHA組G’’值最低，空白組G’’值最高，差異明顯。由圖5E、F可知，凍融7、9 次時，15% WPH組的G’值比空白組分別降低了37.83%和23.17%。

2.6 WPH對反復(fù)凍融肉糜質(zhì)構(gòu)的影響

表1反映了不同凍融循環(huán)處理后豬肉糜硬度、彈性、咀嚼性和內(nèi)聚性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的變化。未凍融時，各組分之間的4 種質(zhì)構(gòu)指標(biāo)均無顯著變化（P＞0.05）。經(jīng)過凍融處理后，空白組與處理組之間存在顯著性差異（P＜0.05）且凍融次數(shù)越多，差異越明顯。其中硬度從未凍融時的186.06～187.73 g降低至151.90～163.07 g，變化最明顯。在凍融7、9 次時，WPH組和0.02% BHA組的彈性和內(nèi)聚性顯著高于未處理組（P＜0.05）。凍融循環(huán)過程中，15% WPH組的硬度和咀嚼性最好，超過0.02%BHA陽性空白組。尤其在凍融9 次時，加入15% WPH后，豬肉糜咀嚼性從9.63 g顯著升高到17 g（P＜0.05）。10% WPH組的咀嚼性與0.02% BHA相似（P＜0.05），且顯著優(yōu)于10% NWP組和空白組（P＞0.05）。凍融3 次時，15% WPH組的內(nèi)聚性與0.02% BHA組無顯著差異（P＞0.05）。在凍融5 次時，15% WPH組的彈性最高達(dá)到0.69，超過0.02% BHA陽性空白組，與其他組差異顯著（P＜0.05）。

表1 WPH對不同凍融循環(huán)豬肉糜質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of WPH on texture properties during repeated freezing-thawing of chopped pork

2.7 WPH對反復(fù)凍融肉糜肌原纖維蛋白拉曼光譜的影響

15% WPH對不同凍融循環(huán)處理后的豬肉糜肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響如圖6所示。通過分析400～2 100 cm-1范圍的拉曼光譜，可以看出不同凍融次數(shù)處理后，1 650 cm-1附近的酰胺I帶和1 250 cm-1附近的酰胺III帶出現(xiàn)明顯變化。未經(jīng)凍融的蛋白質(zhì)α-螺旋含量最高，與其他循環(huán)組差異不顯著（P＞0.05）。隨著凍融次數(shù)的增加，15% WPH可以延緩凍融期間蛋白質(zhì)酰胺I帶的位移，降低蛋白氧化聚合程度，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)作用。

圖6 高劑量組（15% WPH）對不同凍融循環(huán)豬肉糜肌原纖維蛋白拉曼光譜的影響Fig. 6 Effect of 15% WPH on Raman spectrum of myofibrillar protein during repeated freezing-thawing of chopped pork

3 討 論

肉及肉制品反復(fù)凍融后的變化存在多樣性和復(fù)雜性，冰晶的形成、融化及重結(jié)晶的過程不僅會破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，還會引發(fā)一系列的生化鏈鎖反應(yīng)[6,20]。損傷的肌細(xì)胞會釋放出促氧化劑，造成脂肪氧化，產(chǎn)生自由基和氫過氧化物，引發(fā)并加速蛋白質(zhì)的氧化變性[1,21]，誘發(fā)產(chǎn)品品質(zhì)劣變。解凍損失、TVB-N值、TBARS值和羰基含量是衡量冷凍肉持水性、新鮮度、氧化程度的重要指標(biāo)[22]。本實驗中，這4 種指標(biāo)均隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加而上升，這可能是由于冰晶脅迫的氧化會導(dǎo)致蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從致密變得松散，天然構(gòu)象降解或聚集后，使埋藏于內(nèi)部的疏水基團暴露，造成肉體系持水能力下降[23-24]。Cheng Weiwei等[1]證實，蛋白質(zhì)氧化會造成水分遷移流失，使得肉制品的多汁性和質(zhì)構(gòu)變差。Liu Qian[25]和Ayla[26]等研究發(fā)現(xiàn)，貯藏時間的延長會使肌原纖維蛋白羰基含量增加，凝膠組織硬度、彈性、持水力均有所下降。其中添加WPH的豬肉糜解凍損失明顯降低而凝膠質(zhì)地明顯改善，這可能是WPH的添加使得肉糜中水分遷移發(fā)生變化，肽與水、蛋白質(zhì)、脂肪等的結(jié)合方式、結(jié)合力及自身結(jié)構(gòu)等同時也發(fā)生了變化。此外，WPH的加入，對肉糜凝膠致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用，減緩了由反復(fù)凍融導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)的疏松甚至崩塌，保護(hù)了交聯(lián)基團如二硫鍵等的作用力。從而保存了更多的肉糜汁液改善了凝膠理化品質(zhì)。凍融循環(huán)中冰晶的反復(fù)形成會造成肌細(xì)胞破裂，促進(jìn)脂肪氧化，使制品TBARS值升高。同時蛋白氨基酸側(cè)鏈被肌肉中產(chǎn)生的自由基攻擊，使羰基化合物及其衍生物含量增加[1-3]。Jeong[27]和Cheng Weiwei[1]等研究表明，凍融循環(huán)會加速肉品色澤惡化和TBARS值的升高。Zhang Bin等[28]認(rèn)為，冷凍貯藏增加了肌原纖維蛋白對冷凍氧化的敏感性，使得蝦中的羰基含量顯著增加。同時，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生揮發(fā)性氨、二甲胺和三甲胺的速度加快，促進(jìn)了蛋白質(zhì)氧化降解和脂質(zhì)氧化、甚至腐敗的發(fā)生。TVB-N是評估肉品腐敗變質(zhì)程度的重要指標(biāo)，TVB-N值越高，肉品腐敗程度越高[20]。Shao Ying等[20]報道，反復(fù)凍融增加了大口鱸魚TVB-N值，肉質(zhì)有腐敗的趨勢。本實驗結(jié)果還表明，添加WPH，尤其是15%高劑量WPH，可以在肉糜凍融循環(huán)中顯著抑制TBARS值、羰基含量和TVB-N值的升高（P＜0.05），其中多肽組效果明顯優(yōu)于NWP組，這可能是由于蛋白水解后，更多的抗氧化活性基團能夠暴露出來，使抗氧化能力增強。因此大量好氧性微生物的生命活動受到抑制，微生物的分解能力下降，使產(chǎn)品保持更高的新鮮度。Karolina等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在香腸制品中添加5%酸乳清，不僅可以提高產(chǎn)品營養(yǎng)價值，還能顯著提高香腸的風(fēng)味。Martina等[30]研究表明，乳清蛋白及其水解物可以明顯抑制脂肪過氧化，有效清除自由基，具有很強的金屬離子螯合能力。Mulcahy[31]和Li Dongmei[23]等研究也證實，WPH具有改變食品理化性質(zhì)、提高營養(yǎng)和肉品功能特性的作用，已被廣泛用于肉制品加工過程中，在抑制氧化、保證產(chǎn)品質(zhì)量方面發(fā)揮著重要的作用。

越來越多的研究證實，流變性能、凝膠質(zhì)構(gòu)以及拉曼光譜是表征豬肉糜功能特性和蛋白理化性質(zhì)變化的重要指標(biāo)，對肉制品的加工具有重要的現(xiàn)實意義。本研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融循環(huán)后，豬肉糜的硬度、咀嚼性、彈性和內(nèi)聚性都隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加呈現(xiàn)明顯的劣變趨勢。這可能是豬肉糜經(jīng)反復(fù)凍融后已發(fā)生明顯酸敗，細(xì)胞間結(jié)合力減弱，組織結(jié)構(gòu)受到破壞[21]，導(dǎo)致咀嚼性和硬度等性質(zhì)劣變；而且肌肉組織凍結(jié)會使肌原纖維蛋白變性，局部斷裂，肌原纖維蛋白鹽溶性隨之降低[32]，彈性和內(nèi)聚性也被破壞。Ali等[33]研究表明，肉品質(zhì)與蛋白質(zhì)氧化程度密切相關(guān)，多次凍融循環(huán)增加了雞胸肉脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，氧化越嚴(yán)重，肉產(chǎn)品的凝膠質(zhì)構(gòu)會越差[34]，與本實驗結(jié)果一致。在豬肉糜的熱動態(tài)流變性測定中，不同凍融循環(huán)時豬肉糜凝膠G’’整體趨勢大致相同，40～60 ℃之間形成一個最明顯的G’’最大峰值，這是因為溫度升高使得蛋白質(zhì)分子活躍，分子之間開始聚集，形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此造成了很大模量損耗[35]。凍融后期豬肉糜G’’值整體趨勢逐漸紊亂無序，各組差異顯著，這可能是由于多次凍融循環(huán)使豬肉糜結(jié)構(gòu)過度展開，蛋白聚集沉淀，活性功能基團被屏蔽，或是蛋白結(jié)構(gòu)過度展開，導(dǎo)致蛋白變性[36]。5 次凍融循環(huán)后，添加WPH組，雖然能夠抑制肌原纖維蛋白氧化變性（圖4），但豬肉糜的黏性卻下降明顯?？梢?，WPH對反復(fù)凍融豬肉糜蛋白氧化抑制作用與黏性品質(zhì)沒有明顯相關(guān)性。酰胺I帶（1 655f5）cm-1處振動與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，利用拉曼光譜可以有效反映肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)[20]。包括主要集中在（1 655f5）cm-1處的高α-螺旋含量的酰胺I帶振動、1 665～1 680 cm-1處的高β-折疊含量的酰胺I帶振動，此外還有1 680 cm-1附近的β-轉(zhuǎn)角和1 660～1 665 cm-1處的無規(guī)卷曲[37]。本實驗中隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)的α-螺旋出現(xiàn)略微的降低趨勢，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲的含量均呈現(xiàn)不同程度的增加趨勢，說明凍融引起蛋白質(zhì)氧化嚴(yán)重，使C＝O的電子云密度增加，氫鍵之間作用力減弱[38]。Cao Yungang等[39]也發(fā)現(xiàn)，由于肌原纖維蛋白在貯存期間發(fā)生氧化變性，導(dǎo)致蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)破壞、疏水結(jié)構(gòu)域暴露，肌原纖維蛋白的網(wǎng)絡(luò)骨架也隨之改變。本研究發(fā)現(xiàn)，WPH的添加在一定程度上改善了豬肉糜凝膠的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)、抑制模量損耗的升高、增強豬肉的流變性能、提高蛋白質(zhì)α-螺旋的含量，在加溫區(qū)間使流變損耗降到最低。這一方面可能是WPH通過具有良好的抗氧化作用，保護(hù)了豬肉肌原纖維蛋白在反復(fù)凍融過程中的二級結(jié)構(gòu)，對肌原纖維蛋白的降解起到一定的抑制作用，使其黏彈性和流變特性有所改善。另一方面，WPH加入后，與豬肉肌原纖維蛋白相互作用形成精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，束縛住水分，改善了品質(zhì)。

4 結(jié) 論

WPH能夠通過抗氧化作用，在一定程度上抑制氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而減緩蛋白氧化變性，抑制肉糜氧化速度。同時WPH與肉蛋白發(fā)生交互作用，形成保護(hù)層，維持肉體系均勻致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，“鎖住”水分，提高肌肉細(xì)胞間的結(jié)合力，保護(hù)蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)。添加15%WPH處理組的效果最佳，接近甚至優(yōu)于BHA處理組水平?？梢奧PH在肉體系具有較好的抗氧化效果，在改善肉制品品質(zhì)方面有較好的應(yīng)用前景。