張勇強，李智超，厚凌宇，宋立國，孫啟武

（中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局森林培育重點實驗室， 林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091）

土壤微生物與地上植被關系緊密，微生物通過多種方式對地上植被產(chǎn)生作用，地上植被也能夠影響微生物[1-2]。森林是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，其生物多樣性顯著，植物的空間異質(zhì)性明顯，不同經(jīng)緯度、海拔、土壤類型、水熱條件等環(huán)境因素的綜合影響，決定了區(qū)域內(nèi)的植物種類及微生物群落的異質(zhì)性，構成復雜的系統(tǒng)，針對這些系統(tǒng)的微生物群落多樣性及差異的研究意義重大。豐富的土壤微生物群落參與土壤中的養(yǎng)分的循環(huán)與轉化，為植物的生長及發(fā)育提供能量基礎[3]。植物群落對微生物多樣性影響的不確定因素較多，而微生物也影響植物群落穩(wěn)定性。因此有必要利用分子生物學手段，從整體上研究土壤微生物群落代謝多樣性及其對土壤中各碳、氮源的利用情況[4-5]。

BIOLOG 板采用31 種底物誘導微生物代謝，通過顯色反應來測算土壤微生物群落代謝功能多樣性，用來描述土壤微生物群落功能的變化，具有簡便、快速、靈敏和分辨力強等特點[6]。可利用其得到的吸光度平均變化值（AWCD）評價土壤微生物對碳源利用的整體情況及利用活性，通過計算多樣性指數(shù)來評估群落中物種的豐富度、物種的優(yōu)勢度和物種的均一性[7-9]，反映土壤微生物群落的組成及其穩(wěn)定性，進一步了解土壤微生態(tài)的健康情況[9]。BIOLOG 作為簡易的定量分析土壤及環(huán)境碳代謝指紋特征的技術措施，已廣泛運用于農(nóng)田土壤、污染土壤和林地土壤，但對林地土壤的研究主要集中于單一樹種或人工林的研究，很少針對同一山體沿海拔梯度分布的典型天然植被土壤，且對于不同海拔土壤微生物分布格局的研究尚在起步階段[10]。本研究旨在探討典型森林土壤微生物群落代謝特征與差異，解析地上植被和土壤微生物群落的相互關系、不同植被類型下土壤微生物對各碳源的利用情況及微生物碳代謝多樣性與土壤性質(zhì)的相關性，同時探究土壤微生物的代謝多樣性差異與海拔梯度分布格局、植被的關系，旨在為研究同一山體典型天然植被土壤碳代謝指紋特征與差異提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

歷山擁有山西省重要的森林資源，有華北“綠肺”之稱，該山處于中條山脈東段，動植物資源豐富，是研究典型天然植被土壤碳代謝指紋特征與差異的理想場所。該地是亞熱帶向暖溫帶的過渡區(qū)，氣候適宜，為溫帶大陸性季風氣候，年均溫8～12 ℃，年降水量約700 mm主要集中于夏季，主要土壤類型為褐土，無霜期150～180 d，年均相對濕度70%。歷山的主峰為海拔2 321.8 m 的舜王坪，四周草場覆蓋，海拔與地理位置形成了歷山從山頂至山腳豐富的植被帶[11-12]。

1.2 樣地布設及取樣方法

以植被特征為依據(jù)，選擇具有代表性的亞高山草甸（C1），華山松純林（C2），紅樺、榆樹、五角楓、遼東櫟闊葉混交林（C3），榆樹、核桃楸、青皮椴、遼東櫟闊葉混交林（C4），白樺、青皮椴、核桃楸、華北落葉松、油松針闊混交林（C5），白皮松、油松針葉林（C6），油松純林（C7）7 種不同海拔典型森林（草甸）植被，每種植被選擇3 塊20 m×20 m 的樣地，樣地概況見表1。每塊樣地調(diào)查植物種類，采用S 型取樣法取樣方內(nèi)5 點的0～20 cm 土壤樣品，混合裝入土袋，帶回實驗室放4 ℃冰箱中待測。

1.3 實驗方法

用含有31 種碳源的BIOLOG-ECO 板，進行土壤微生物群落碳代謝實驗。采用Classen 等[13]的方法制備生態(tài)板接種液。首先稱取相當于30 g烘干土重的鮮土加入到盛有270 mL 濃度為0.85%的NaCl 溶液的三角瓶中180 r/min 震蕩30 min，取3 mL 上清液加入到27 mL NaC1 溶液，混勻后再取3 mL 上清液加入到27 mL NaCl 溶液，土壤溶液最終稀釋至10-3。用排槍吸取150 μL 的稀釋液加入ECO 板的各孔中。將接種好的微孔板放在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。分別于24、48、72、96、120、144、168 h 在Micro Log TM Version 4.20.05微孔板讀數(shù)儀（Biolog Inc，USA）上進行測定，對波長90 nm（顏色+濁度）和750 nm（濁度）的數(shù)值進行處理計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

土壤微生物群落的功能多樣性采用通過72 h的測定數(shù)據(jù)計算。微生物群落利用碳源的總能力用平均顏色變化率（AWCD）表示，計算方法如下：

式中：Ci為第i個碳源孔的兩波段光密度差值，R為對照孔的吸光度值，n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)Shannon-Wiener 指數(shù)（H′）表示被利用的碳源的總數(shù)，對稀疏種敏感，可用于評估物種的多樣性[14]，計算方法如下：

表1 樣地基本情況Table 1 Basic condition of plots

式中：Pi表示第i個非對照孔中的吸光值與所有非對照孔吸光值總和的比值，即Pi=(Ci-R)/ Σ(Ci-R)[15]。

Pielou 指數(shù)（J）[16]可用于評估物種均勻度，計算方法如下：

式中：S為被利用的碳源總數(shù)。

Simpson 指數(shù)（D）[17]可用于評估物種豐富度，計算公式如下：

McIntosh 指數(shù)（U）是均一性的量度，是基于群落物種多維空間距離的多樣性指數(shù)，計算公式如下：

式中：Ni是第i孔的相對吸光值；

采用Excel 2003 統(tǒng)計并處理數(shù)據(jù)，R 軟件對各時段AWCD 值及72 h 多樣性指數(shù)進行單因素方差分析確定其顯著性，對各典型植被進行主成分分析并計算得分，確定其土壤微生物主要利用碳源，用GraphPad PRISM?軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物群落對碳源的利用特性及不同碳源變化特征

2.1.1 土壤微生物對所有碳源利用的變化特征

土壤微生物對單一碳源的利用能力可以通過AWCD 值反映[18]。由圖1 可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，所有植被類型AWCD 值不斷增加，即微生物利用碳源量不斷增加。培養(yǎng)時間24 h 以內(nèi)，所有植被類型下AWCD 值最低，表明土壤微生物活性較低，碳源基本未被利用。24～48 h 內(nèi)，AWCD 值變化的斜率最大，表明在這段時間內(nèi)微生物對碳源的利用速率最高。72 h 以后，AWCD的變化速率逐漸降低，微生物對碳源的利用逐漸區(qū)域穩(wěn)定。168 h 后，AWCD 值基本到達最大值，各植被類型下土壤微生物群落對碳源利用的大小順序為：C5 ＞C1 ＞C4 ＞C3 ＞C6 ＞C7 ＞C2，且差異顯著（P＜0.05）。7 種植被類型中，白樺、青皮椴、核桃楸、華北落葉松、油松針闊混交林中土壤微生物群落代謝活性最高（1.265），其次為亞高山草甸（1.195），華山松最低（0.876）。

2.1.2 不同植被類型下土壤微生物對不同碳源利用的強度分析

BIOLOG 生態(tài)板的31 種碳源底物分為6 大類：碳水化合物、氨基酸、羧基酸、多聚類、酚酸類、胺類，其中，碳水化合物12 種，氨基酸6 種，羧酸類5 種，多聚類4 種，酚酸類2 種，胺類2 種。圖2為6類碳源在7種典型植被下利用的整體情況，可以看出各類碳源在不同植被類型下差異顯著。碳水化合物類是7 種植被利用的主要碳源，其次為氨基酸類或羧酸類，多聚物類、酚類和胺類的代謝較少。

圖1 不同植被類型土壤微生物群落AWCD 隨時間變化Fig.1 Changes of soil AWCD in different vegetation types with time

2.2 微生物代謝多樣性

根據(jù)第72 h 的AWCD 值計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）、McIntosh 多樣性指數(shù)（U）、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)（D）和Pielou 均勻度指數(shù)（J）。由表2 可知，Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H′）C4、C1、C5 較高，均大于4，C3、C6 次之，在3～4之間，C7、C2 較小，均小于3，較高的Shannon-Wiener 指數(shù)代表微生物種類多且分布均勻，7 種不同植被類型下微生物群落多樣性在榆樹、核桃楸、青皮椴、遼東櫟闊葉林最高，亞高山草甸，白樺、青皮椴、核桃楸、華北落葉松、油松針闊混交林中較高，紅樺、榆樹、五角楓、遼東櫟闊葉林，白皮松、油松針葉林中次之，在油松、遼東櫟針闊混交林較低，華山松純林中最低。McIntosh 多樣性指數(shù)（U）反映了碳源利用種類數(shù)的不同，能以此區(qū)分不同碳源的利用程度，Pielou 均勻度指數(shù)（J）反映了全部微生物種群個體數(shù)目的分配狀況，二者與Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)大致呈相同的大小規(guī)律，而Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)（D）可反映群落中最常見物種，與前三者大小規(guī)律相反。

圖2 土壤微生物對六類碳源的利用情況Fig.2 Utilization of six carbon sources by soil microorganisms

表2 不同植被類型土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices for soil microbial communities of different vegetation types

2.3 土壤微生物群落碳代謝功能主成分分析

分別對7 種典型森林植被土壤微生物對碳源的利用進行主成分分析，提取前兩個成分，并通過R軟件程序包計算微生物對碳源利用情況得分，選擇得分前5 的碳源對應微孔列于表3。微平板各孔所對應的碳源類型及種類如表4 所示。主成分分析結果顯示：在不同植被類型下，土壤微生物主要利用的碳源類型差別明顯，沒有某一單一碳源在7 種植被類型中處于絕對優(yōu)勢的地位，不同于圖2 不同類碳源的變化規(guī)律，表明圖2 結果中不同類碳源代謝優(yōu)勢地位不是某一碳源代謝的結果，可能是由于該類別碳源種類多造成的。對于碳源代謝多樣性的研究，表3 比圖2 意義更大。

表3 主成分分析得分排名Table 3 Ranking of principal component analysis scores

表4 31 種碳源分類及對應微孔Table 4 Classification of 31 carbon sources and corresponding micropore

3 討 論

3.1 典型植被土壤碳代謝差異

典型植被由于植物種類不同，所處環(huán)境不同，微生物群落具有較大差異，研究土壤微生物群落代謝多樣性，對揭示植物-土壤-微生物之間的關系意義深遠[19]。眾多研究結果表明，土壤微生物群落代謝活性主要與枯落物數(shù)量和組成有關，不同植物產(chǎn)生不同種類不同數(shù)量的枯落物，影響土壤性質(zhì)，從而造成土壤微生物的差異[20-22]。在吳則焰等[23]對武夷山青岡和米櫧兩種天然林及馬尾松和杉木兩種人工林土壤微生物多樣性研究中，指出天然林土壤微生物群落多樣性高于人工林，闊葉林高于針葉林。朱平等[24]在對祁連山墊狀植被、高寒草甸、沼澤化草甸和高寒灌叢的研究中指出，沼澤化草甸和高寒草甸的土壤微生物對主要碳源的利用率高于灌叢草甸和墊狀植被，分析認為，草地土壤表層根系密集，凋落物和根系分泌物為微生物提供豐富能源[23,25]，枯落物數(shù)量較大且易分解，土壤含水率高，更適合微生物生長。鄧嬌嬌等對不同利用方式土地土壤微生物的研究[26]指出，土壤微生物多樣性闊葉林林＞灌木林＞針葉林＞耕地，對黑土區(qū)水土保持林的研究[28]指出，土壤微生物多樣性表現(xiàn)同樣為闊葉林＞針葉林。Hackl 等[29]對不同類型天然林土壤微生物群落組成研究中也指出，針葉凋落物含有大量木質(zhì)素和丹寧酸，難以分解，需要特定的微生物負責降解這些頑固的有機化合物，因此導致土壤中微生物群落多樣性較差。綜合以上的結果及本文的研究，我們認為土壤微生物代謝多樣性在典型森林（含草甸）土壤下應該具有以下規(guī)律：針闊混交林（以闊葉林為主）＞草甸＞闊葉林＞針葉林。本研究中海拔1657 m 左右的針闊混交林，由于枯落物組成復雜且數(shù)量較多，水熱條件較好，土壤微生物群落多樣性較高，而海拔2180 m 左右的華山松純林，雖然存在很厚的枯落物層，但枯落物種類單一，加之由于海拔的升高導致的水熱條件變差，微生物及酶活性降低，其土壤微生物群落碳代謝活性最低。

3.2 土壤微生物代謝指紋特征

植物的組成及多樣性與土壤微生物的生產(chǎn)及代謝活動是相互影響，相輔相成的[30]，土壤微生物對各碳源的利用情況可以反映土壤碳源轉化及土壤微生物代謝多樣性[31]。綜合以上研究結果，在BIOLOG 所研究的31 種碳源中，微生物對碳水化合利用最高，與之前研究一致[23,26,27]，而通過對不同碳源得分利用率的得分排名在之前的研究中則很少體現(xiàn)，這一結果可以在一定程度上反映不同植物對微生物分解后產(chǎn)物的利用情況，為不同植被類型代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)種類及數(shù)量提供參考。通過對每種典型植被土壤微生物利用碳源情況分析，了解各類碳源在不同環(huán)境下微生物代謝的重要程度，以針對性的補充植物生長發(fā)育所必須的碳源，對森林植物的生長發(fā)育意義重大。

3.3 土壤微生物代謝多樣性

土壤微生物群落結構多樣性的主導因素是與土壤本身的理化性質(zhì)和植被狀況有關[32-34]，生態(tài)學中采用不同的生態(tài)學指數(shù)反映群落內(nèi)部物種總數(shù)和物種相對多度，多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)代表微生物種類多且主要物種豐富，而均勻度指數(shù)反映土壤群落中普遍存在的物種。本研究中闊葉林中多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)最高，其次為亞高山草甸和針闊混交林，但與其他人研究結果不同的是三種植被下均勻度指數(shù)較小，表明這三種植被類型中微生物種類多但分布不均勻，沒有較突出的優(yōu)勢種，利于枯落物的分解和轉化，促進養(yǎng)分的循環(huán)和積累。華山松純林中多樣性指數(shù)指數(shù)均最低，均勻度指數(shù)最大，表明其土壤中微生物種類較少，單一微生物種突出，不利于枯落物的分解轉化，從而導致華山松體內(nèi)養(yǎng)分積累慢，不利于其生長，這也是一些高海拔華山松樹高和胸徑受到限制的原因之一。

3.4 微生物多樣性的影響因素

濕度、溫度、光照等眾多環(huán)境因素均受海拔變化的影響，研究海拔梯度對微生物多樣性保護、生物代謝多樣性分布特征及驅動因素的意義重大。Bryant JA 等[35]在對海拔梯度與微生物關系的研究中初次提出：土壤微生物多樣性的海拔格局與植物多樣性分布差異顯著，與植物多樣性的單峰模式不同，土壤細菌物種豐富度隨海拔升高呈現(xiàn)單調(diào)遞減模式。Shenc 等[36]在對長白山不同海拔植被土壤微生物研究指出，微生物多樣性隨海拔并沒有明顯的規(guī)律。Singh 等對日本富士山[37]北坡土壤的研究顯示，土壤微生物沿海拔梯度具有單峰的分布格局，而對韓國漢拿山[38]的研究顯示，土壤細菌多樣性在中海拔較低，而低海拔和高海拔相對較高，表明山地生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物豐富度和多樣性并沒有一致的分布格局。此外，也有一些最新的研究利用高通量測序技術揭示了沿海拔下降的土壤微生物多樣性分布模式[39,40]。根據(jù)目前的研究，土壤微生物多樣性的海拔分布并未明確傾向于某種分布模式，本研究中土壤微生物的代謝多樣性同樣也沒有與海拔梯度有某種確切聯(lián)系，反而與植物的種類及多樣性呈正相關關系，植物種類越豐富，其微生物代謝功能及多樣性越強。

3.5 本研究局限及下一步研究方向

通過BIOLOG 技術，我們討論了歷山典型植被土壤碳代謝指紋特征與差異，雖對不同海拔植被類型都做了研究，但微生物碳代謝的影響因子并沒有量化。海拔對微生物多樣性的影響是眾多環(huán)境因子共同作用的結果，由于時間的局限性，研究并沒有對各植被類型的環(huán)境因子做出長期監(jiān)測，以分析究竟哪一或哪些因子對微生物多樣性的影響更為顯著。另外，研究采取的方法較為簡單，但同樣存在局限性，其局限在于并未對微生物物種在某一水平上進行鑒定，無法比較微生物物種多樣性在不同植被類型間的差異及海拔對不同物種微生物多樣性的影響。針對以上局限性，我們下一步的研究方向為在各植被類型下設立觀測點，以年為周期長期監(jiān)測各環(huán)境因子，并在監(jiān)測后對土壤進行重新采樣，采用高通量測序等技術[41]對土壤微生物物種多樣性進行鑒定。

4 結 論

本文調(diào)查研究了亞高山草甸（C1），華山松純林（C2），紅樺、榆樹、五角楓、遼東櫟闊葉混交林（C3），榆樹、核桃楸、青皮椴、遼東櫟闊葉混交林（C4），白樺、青皮椴、核桃楸、華北落葉松、油松針闊混交林（C5），白皮松、油松針葉混交林（C6）、油松純林（C7）7 種典型森林土壤中的微生物多樣性，結果顯示，7 種典型森林土壤微生物對31 種碳源的綜合利用能力順序如下：C5 ＞C1 ＞C4 ＞C3 ＞C6 ＞C7 ＞C2，白樺、青皮椴、核桃楸、華北落葉松、油松針闊混交林土壤中微生物群落利用碳源的能力最強，華山松純林最低。各多樣性指數(shù)也反映出同樣的規(guī)律。

各植被類型下土壤微生物群落對各碳源的利用的主成分分析研究結果顯示，不同植被類型下土壤微生物代謝碳源程度各異，綜合31 種碳源的利用，碳水化合利用率最高，其次依次為氨基酸、羧酸類、多聚類、酚酸類，胺類碳源的利用率最小。

土壤微生物代謝多樣性與海拔梯度并無規(guī)律性關系。研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物代謝多樣性與地上植物種類及多樣性密切相關，地上植物種類和數(shù)量越豐富，其土壤中微生物代謝活動越強，代謝多樣性越高。