陳燦燦 李 杰 付 琳 孫曉燕 王高富周 鵬 馬友記 任航行

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,甘肅 蘭州 730070;2重慶市畜牧科學院,重慶 402460)

酉州烏羊(Capra hircus)是重慶特有的山羊品種,該羊全身被毛為白色,皮膚、嘴、眼、鼻、陰門和肛門等處的可視黏膜均為烏色,這種表型是一類罕見的纖維色素增生(fibromelanosis)現(xiàn)象,此前僅在家禽中出現(xiàn)過。此外,酉州烏羊的肉滋補作用極高,是食藥兼用的優(yōu)良品種,也被稱為“藥羊”,且可作為醫(yī)學研究模型[1]。因此,對酉州烏羊這種珍稀品種資源進行研究具有重要的意義[2]。

miRNA 是一類長度約為18 ～22 個核苷酸具有調(diào)控功能的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA,具有高度保守性、時序性和組織特異性[3]。miRNA 通過完全或不完全的堿基互補配對結(jié)合靶基因的3′-UTR 抑制靶基因的表達,進而影響細胞的分化、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等[4-5]。大量研究表明,在毛色形成過程中參與毛色形成的基因較多,其中起重要作用的基因主要有黑素皮質(zhì)素受體1(melanocortin 1 receptor,MC1R)[6]、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia associated transcription factor,MITF)[7]、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)家 族[8]、α-促黑素細胞激素(melanocyte stimulating hormone α,α-MSH)[9]、Agouti 信號蛋白(agouti signaling protein,Asip)[10]等,且miRNA 可能調(diào)控這些基因的表達,進而參與黑色素的合成,如miR-146 抑制色素合成基因TYRP1 的表達[11]、miR-137 抑制CKT/TYRP2 的表達[12]、miR-324-3p 和miRNA-338-3P 抑制MC1R的表達等[13-14]。通過targetscan等軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-29a-5p 與鼠灰色基因(agouti singaling protein,Asip)存在靶向調(diào)控關(guān)系。而Asip 又是經(jīng)典的生黑色素通路(KEGG:melanogenesis)中最上游的一個關(guān)鍵負調(diào)控因子,但Asip在不同被毛顏色的山羊組織可能存在不同的調(diào)控機制[6,15]。Asip和α-MSH基因競爭性地與黑色素細胞膜上的MC1R基因結(jié)合,引起黑色素細胞內(nèi)真黑色素、褐黑色素的比例發(fā)生變化。α-促黑素細胞激素與MC1R 結(jié)合后,毛囊黑素細胞產(chǎn)生真黑色素(黑色/棕色),這種激素與黑色素細胞膜的結(jié)合如果被Agouti基因座編碼的Agouti 信號蛋白(Asip)阻斷,則生成褐黑色素[16]。此外,miR-29a 在各種腫瘤細胞中高表達,具有顯著的促增殖、抗凋亡的作用,推測miR-29a 很可能通過調(diào)控黑色素細胞的行為學影響山羊皮膚黑色素的合成[17-18]。本研究分析酉州烏羊miR-29a 的組織表達譜及其在成熟的商品化B16 細胞增殖與分化過程中的動態(tài)表達規(guī)律,以期為明確miR-29a 在酉州烏羊各組織中的表達特性及其是否參與黑色素細胞行為學的調(diào)控提供理論證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

12 月齡左右酉州烏羊的各種體組織和渝東白山羊的皮膚均來自于酉陽縣酉州烏羊國家級保種場,每組3 個生物學重復(fù)。組織采集參考趙亞運等[19]的方法,采集后用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)水清洗,置于凍存管中,然后迅速投入液氮中,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B16 細胞由重慶市山羊工程技術(shù)研究中心保存。TRIzol Reagent 購自美國invitrogen 公司;miRcute Plus miRNA Fast-Strand cDNA Kit 與miRcute Plus miRNA qPCR Kit 購自北京TIANGEN 公司;DMEM 和RPMI 1640 培養(yǎng)基購自北京gibco 公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、馬血清(horse serum,HS)和青鏈霉素購自新西蘭HyClone 公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)miRBase 中已經(jīng)公布的羊源miR-29a(MIMAT0014967)的相關(guān)序列,進行引物設(shè)計,以U6為內(nèi)參,然后用NCBI 中的BLAST 檢測引物特異性,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Reverse Primer 為反轉(zhuǎn)錄試劑盒自帶通用引物。設(shè)計的引物序列信息詳見表1。

1.3 B16 細胞增殖及分化培養(yǎng)

用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基復(fù)蘇B16 細胞,使用完全培養(yǎng)基重懸細胞,并按照1.0×105個·mL-1鋪板六孔板中,每個板設(shè)3 個重復(fù)。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換1 次培養(yǎng)基。觀察細胞的生長狀況并拍照,取一板細胞用于提取RNA。使用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,待細胞長至70%～90%,吸棄增殖培養(yǎng)基。用含2%雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗2～3 次,加入分化培養(yǎng)基,培養(yǎng)基成分為DMEM+2%HS+2%雙抗。分化第4 天以后,每天更換培養(yǎng)基。用Olympus IX73 熒光倒置顯微鏡(Olympus,日本)觀察細胞并拍照,每個樣品隨機拍3 個視野,比例尺為200～500 μm。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄

用液氮快速研磨組織后,按照TRIzol Reagent提取試劑盒(Inritorgen 公司,美國)的操作說明書提取各組織和細胞總RNA。提取細胞RNA 時,吸棄培養(yǎng)基后,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液清洗2 ～3 次,加入TRIzol 提取RNA。使用D2000 超微量分光光度計(ThermoFisher,美國)檢測總RNA 的濃度與純度,OD 值均在1.8 ～2.0 之間。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,選擇完整性良好的RNA,將其按照miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA 合成試劑盒操作說明,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存?zhèn)溆?。按照體系:cDNA 1 μL、內(nèi)參引物各為0.4 μL、mix 酶5 μL、RNase ddH2O 3.2 μL,進行常規(guī)PCR 擴增,并檢測反轉(zhuǎn)錄結(jié)果。

1.5 實時熒光定量PCR

按照miRcute Plus miRNA qPCR Kit 建議的體系,在相同條件下,對退火溫度55～65℃進行優(yōu)化,細胞和組織均以U6 為內(nèi)參進行PCR 擴增。反應(yīng)體系為20 μL:2×mircute plus mirna premix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,RNase ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性15 min;94℃變性20 s,60℃退火34 s,共40 個循環(huán);溶解曲線分析程序:95℃變性15 s,60℃退火1 min,熒光信號采集時間為5 s。根據(jù)熒光定量所得的Ct 值,采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 22 軟件進行單因素方差分析并檢驗其顯著性,結(jié)果以平均值±標準誤(SE)表示。P＜0.05 表示差異顯著,P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酉州烏羊不同組織中miR-29a 的表達特性

2.1.1 miR-29a 的組織表達譜 由圖1 可知,miR-29a 在酉州烏羊不同組織中均有不同程度的表達,且相對表達量存在差異,其中在大腦中的相對表達量最高,腿肌和心臟次之,在肺和皮膚中表達量最低。

圖1 miR-29a 在酉州烏羊不同組織中的表達分析Fig.1 Expression analysis of miR-29a in different tissues of Youzhou dark goats

2.1.2 miR-29a 在酉州烏羊與渝東白羊皮膚組織中的表達 由圖2 可知,miR-29a 在不同膚色羊皮膚組織中均有表達,但在渝東白山羊皮膚中miR-29a 的相對表達量極顯著高于酉州烏羊(P＜0.01),渝東羊皮膚中miR-29a 的相對表達量是烏羊皮膚的3.44 倍,與前期測序結(jié)果一致[20]。表明miR-29a 可能與皮膚黑色素沉積有關(guān)。

圖2 miR-29a 在酉州烏羊與渝白羊皮膚組織中的相對表達量Fig.2 Relative expression of miR-29a in skin tissues of Youzhou dark goats and Yudong white goats

2.2 miR-29a 在B16 細胞增殖階段的動態(tài)表達

B16 細胞在增殖介質(zhì)中培養(yǎng)2、4、6 和8 d 時,RTqPCR 檢測發(fā)現(xiàn),miR-29a 在各時間點均有表達,且其相對表達量隨著培養(yǎng)時間的延長呈升高趨勢(圖3)。顯微鏡下形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),在第0 天時B16 細胞數(shù)量較少,細胞結(jié)構(gòu)清晰;第4 天細胞基本鋪滿整個六孔板底部,細胞結(jié)構(gòu)模糊,幾乎分辯不出單個細胞;到第8天時,細胞成云海狀(圖4)。以上結(jié)果表明,miR-29a的遞增表達可能促進了B16 細胞的增殖。

圖3 miR-29a 在B16 細胞增殖階段的相對表達量Fig.3 Relative expression of miR-29a in the proliferation phase of B16 cells

2.3 miR-29a 在B16 細胞分化階段的動態(tài)表達

將B16 細胞在分化介質(zhì)中培養(yǎng)8 d,通過RTqPCR 分別檢測細胞分化第2、第4、第6、第8 天時miR-29a 的相對表達量(U6 為內(nèi)參),結(jié)果表明,在分化第4、第6、第8 天的B16 黑色素細胞中miR-29a 相對表達量差異不顯著(P＞0.05),但都極顯著低于分化第2天的相對表達量(P＜0.01,圖5)。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),加入分化培養(yǎng)基后,第2 天B16 黑色素細胞數(shù)目仍持續(xù)增加,第4、第6、第8 天細胞數(shù)量穩(wěn)定,細胞核周圍出現(xiàn)大量黑色素體,黑色素分泌量增加,相較于增殖階段細胞突觸增多且變長,細胞間通過突觸相互交聯(lián)。上述結(jié)果表明,miR-29a 的低表達可能有助于黑色素細胞的分化和黑色素生成(圖6)。

圖4 B16 黑色素細胞不同日齡的增殖結(jié)果Fig.4 Proliferation results of B16 cells at different day ages

3 討論

miR-29a 參與了多種腫瘤的發(fā)生[21-22],但目前miR-29a 在皮膚黑色素沉積方面的研究尚鮮見報道。本研究通過RT-qPCR 檢測酉州烏羊不同組織中的miR-29a 表達,結(jié)果顯示,miR-29a 在酉州烏羊不同體組織中廣泛表達,表明miR-29a 無組織特異性,這與王健等[23]在湖羊上研究結(jié)果基本一致。但miR-29a在酉州羊大腦中的相對表達量顯著高于其他組織,一方面,可能是由于miR-29a 能夠通過靶向作用于PTEN基因促進神經(jīng)元分化并減少神經(jīng)干細胞的星形膠質(zhì)細胞分化[24];另一方面,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中,隨著膠質(zhì)瘤惡性級別的升高,miR-29a 表達量降低[25-26]。因此在酉州烏羊健康腦組織中miR-29a 呈高表達,可能會抑制腫瘤的發(fā)生[27]。此外,本研究還觀察到miR-29a 在酉州烏羊皮膚與肺中的相對表達量低于其他組織,但是渝東白羊皮膚miR-29a 相對表達量是酉州烏羊皮膚的3.44 倍,推測miR-29a 可能與皮膚黑色素沉積有關(guān)。

圖5 miR-29a 在B16 細胞分化階段的相對表達量Fig.5 Relative expression of the miR-29a in differentiation stage of B16 cells

圖6 B16 細胞不同日齡分化結(jié)果Fig.6 Differentiation results of B16 cells at different day ages

大量研究表明,在癌癥組織中miR-29 均下調(diào)表達[28-29],然而在神經(jīng)干細胞分化過程中miR-29a 表達水平上調(diào)[24]。本研究體外試驗發(fā)現(xiàn),在增殖條件下,B16 細胞中miR-29a 的相對表達量隨著培養(yǎng)時間的延長呈升高趨勢,且各時間點表達差異明顯,暗示miR-29a 可能與黑色素細胞的增殖密切相關(guān)。在B16 細胞分化階段,miR-29a 相對表達量整體呈降低趨勢,即第4、第6、第8 天的細胞中miR-29a 相對表達量都極顯著低于分化第2 天,說明miR-29a 的低表達可能有助于B16 細胞分化及黑色素的生成。陳金妹等[30]研究表明,B16 細胞在RPMI-1640 培養(yǎng)基中的活力和分裂增殖能力較強,細胞產(chǎn)生黑色素能力較弱,與本研究結(jié)果基本一致。本研究在B16 細胞增殖階段選擇使用RPMI1640 培養(yǎng)基,形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),細胞在第2 天開始出現(xiàn)樹突,但突觸較短小,第8 天有少量黑色素分泌,這可能是不同廠家或者不同批次的培養(yǎng)基成分略有差異造成的。推測miR-29a 可能通過調(diào)節(jié)ASIP 的表達來調(diào)控黑色素細胞的增殖、分化過程,進而導(dǎo)致酉州烏羊和渝東白羊2 個品種山羊皮膚黑色素沉積存在差異。但要獲得miR-29a 參與黑色素細胞行為學調(diào)控的直接證據(jù),還需要通過建立miR-29a 的過表達載體并轉(zhuǎn)染黑色素細胞進行進一步的驗證。

4 結(jié)論

本研究體內(nèi)試驗結(jié)果表明,miR-29a 在酉州烏羊體內(nèi)各組織廣泛表達,其中在肺和皮膚中的相對表達量最低,在大腦中相對表達量最高;渝東白羊皮膚中miR-29a 相對表達量是酉州烏羊的3.44 倍。體外試驗研究發(fā)現(xiàn),miR-29a 的相對表達量隨著B16 細胞的增殖而升高,但隨著B16 細胞的分化而降低,推測miR-29a 與B16 細胞的增殖與分化密切相關(guān)。本研究為miR-29a 參與黑色細胞行為學的調(diào)控提供了一定的理論依據(jù)。下一步可通過構(gòu)建miR-29a 慢病毒載體并轉(zhuǎn)染B16 細胞,探究miR-29a 對B16 細胞行為學變化的影響。