王義春，王龑，江均平，趙月菊，邢福國(guó)，周露

·生物技術(shù)與方法·

玉米赤霉烯酮降解酶多拷貝畢赤酵母菌株的構(gòu)建及高效表達(dá)

王義春，王龑，江均平，趙月菊，邢福國(guó)，周露

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

通過(guò)密碼子優(yōu)化、體外多拷貝構(gòu)建實(shí)現(xiàn)玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEN) 降解酶基因 (6) 在畢赤酵母GS115菌株中的高效表達(dá)。按酵母密碼子偏好性優(yōu)化-6基因的密碼子，與α因子信號(hào)肽編碼序列一起合成，插入到pAO815質(zhì)粒中，通過(guò)酶切酶連構(gòu)建含1–6個(gè)表達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母 GS115菌中，獲得ZEN降解酶重組菌株。重組蛋白分子量為28.9 kDa，與預(yù)期一致。重組菌用甲醇誘導(dǎo)3 d，蛋白濃度達(dá)最高，之后下降；在pH 5.0、4.5條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)量最高；每天添加0.8%的甲醇、接種量10%表達(dá)水平最高；4拷貝的轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平最高，三角瓶發(fā)酵3 d，酶活性達(dá)到10 U/mL。在1 g玉米渣中添加0.1–0.5 mL發(fā)酵上清液，水解24 h，玉米渣中ZEN的降解率為44.08%–75.51%。研究結(jié)果為ZEN降解酶工業(yè)生產(chǎn)及在食品飼料中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

玉米赤霉烯酮，降解，6，高效表達(dá)，多拷貝，畢赤酵母

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，為2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素。ZEN具有雌激素活性，對(duì)生殖發(fā)育系統(tǒng)有毒害作用。攝入ZEN超標(biāo)的母豬會(huì)出現(xiàn)外陰和乳腺腫大甚至陰道及直腸脫垂的癥狀[1]。ZEN有致癌性，能導(dǎo)致DNA收斂、染色體斷裂[2]，還可能通過(guò)雌激素受體通路和抑制凋亡促進(jìn)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞的體外增 殖[3]。Yang等[4]研究發(fā)現(xiàn)ZEN能導(dǎo)致老鼠變態(tài)精子數(shù)增加、精子的活力下降，同時(shí)受孕降低。梁梓森等[5]研究證明ZEN有血液毒性，可導(dǎo)致小鼠淋巴細(xì)胞明顯減少(<0.05)，白細(xì)胞及其他各組分細(xì)胞升高，血小板數(shù)量明顯減少。

目前ZEN的降解方法主要有物理法 (高壓加熱[6]、輻照[7]、吸附劑吸附[8])、化學(xué)法 (臭氧、雙氧水和碳酸鈉處理[9-11]) 和生物法 (微生物菌體吸附、酶降解)。傳統(tǒng)物理化學(xué)方法有一定的局限性，如破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、引入化學(xué)物質(zhì)造成再次污染等。生物學(xué)方法具有反應(yīng)條件溫和、無(wú)化學(xué)試劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，受到了人們的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，ZEN的生物降解有了一定進(jìn)展。許多能降解ZEN的菌被分離發(fā)現(xiàn)，其中一些關(guān)鍵酶的基因已被克隆表達(dá)。來(lái)自粉紅黏帚霉的ZEN降解酶基因101、6、jjm被成功克隆表達(dá)，重組蛋白均表現(xiàn)出較強(qiáng)的水解ZEN的能力[12-18]，粗糙脈孢ZEN水解酶基因 () 也獲得了較高表達(dá)[19]。柴成梁等[20]分離到一種高比活玉米赤霉烯酮降解酶ZHD795，其比活是粉紅黏帚霉ZEN降解酶的2.5倍。將ZEN降解酶基因轉(zhuǎn)入玉米也有降解ZEN的活性[21]。另外，不動(dòng)桿菌過(guò)氧化物酶也具有降解ZEN的能力[22]。但總的說(shuō)來(lái)，玉米赤霉烯酮降解酶發(fā)酵水平還不高，還需要進(jìn)一步提高產(chǎn)酶水平降低生產(chǎn)成本。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前使用最多、最廣泛的生產(chǎn)外源蛋白的工具之一[23]，其表達(dá)載體pAO815能體外構(gòu)建多拷貝質(zhì)粒，可以方便獲得多拷貝菌株。據(jù)報(bào)道粉紅黏帚霉降解酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適反應(yīng)pH值為8.5，在50 ℃以下穩(wěn)定，并對(duì)酸性環(huán)境有一定耐受能力，對(duì)玉米醪中的ZEN的降解率達(dá)72.70%，具有潛在的實(shí)用價(jià)值[24]。本研究對(duì)該酶的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，體外構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體，以期獲得高效表達(dá)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

TOP10感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pAO815質(zhì)粒、GS115菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶(R Ⅰ、Ⅱ、H Ⅰ、Ⅰ)、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自日本TaKaRa公司；小牛腸堿性磷酸酶 (CIP)購(gòu)自NEB公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志公司；YNB購(gòu)自BD公司；D-山梨醇、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；玉米碴購(gòu)自超市發(fā)；乙腈、甲醇 (色譜級(jí)) 購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；其他分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與器材

紫外凝膠成像儀，美國(guó)Alpha Innotech公司；凝膠電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；PCR擴(kuò)增儀，日本TaKaRa公司；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；C18液相色譜柱，美國(guó) Agilent公司；電擊轉(zhuǎn)化儀，美國(guó)BTX公司；恒溫振蕩搖床，上海智誠(chéng)公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

單拷貝表達(dá)載體構(gòu)建：編碼粉紅黏帚霉.玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6 (NCBI GenBank登錄號(hào)：HQ825318) 按.酵母偏好密碼子優(yōu)化，和α信號(hào)肽編碼序列整體 (--6) 化學(xué)合成，并在--6片段5′-、3′-端分別引入Ⅰ、RⅠ酶切位點(diǎn)。pAO815質(zhì)粒用RⅠ酶切、CIP去磷酸化，含--6片段的質(zhì)粒用Ⅰ/RⅠ酶切，電泳回收基因片段，基因片段和載體按摩爾比3∶1–5∶1用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，用氨芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序，選擇插入方向正確的pAO815--6表達(dá)載體。

多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建：以質(zhì)粒pAO---6為模板，用引物(GGAagatctAACATCCAAAGACG/ TAggatccGCACAAACGAAC，小寫字體為引入的Ⅱ和HⅠ酶切位點(diǎn)) PCR擴(kuò)增得到完整表達(dá)框5′AOX---6-3′AOX-TT3′；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。用試劑盒純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pGM-T載體，測(cè)序，獲得正確的pGM-5′AOX---6-3′AOX- TT3′質(zhì)粒。該質(zhì)粒經(jīng)Ⅱ、HⅠ雙酶切，回收表達(dá)框，與經(jīng)HⅠ酶切、CIP去磷酸化的pAO---6質(zhì)粒酶連，得到含2個(gè)表達(dá)盒的pAO-(--6)2表達(dá)載體。獲得的2拷貝表達(dá)載體再與2拷貝表達(dá)框進(jìn)行酶切、酶連、轉(zhuǎn)化，如此反復(fù)制備4拷貝、6拷貝的表達(dá)載體。

1.2.2 玉米赤霉烯酮降解酶重組酵母菌株的構(gòu)建及鑒定

畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備及電擊轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)[25]進(jìn)行。表達(dá)載體用Ⅰ線性化，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)，取20 μL復(fù)蘇培養(yǎng)菌液涂布MD平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3–5 d，隨機(jī)從MD平板上挑取 5個(gè)單菌落，分別接入5 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)36 h，500×室溫離心5 min收集菌體。菌體用2 mL BMMY培養(yǎng)基重懸，30 ℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d，期間每隔24 h補(bǔ)加甲醇至0.5%，培養(yǎng)結(jié)束后，12 000×離心5 min收集上清液，用SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白，采用串聯(lián)質(zhì)譜 (MS-MS) 分析表達(dá)蛋白的分子量。

為比較不同拷貝轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)量，用相同菌密度的轉(zhuǎn)化子在同體積的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。取15 μL發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE，利用凝膠圖像分析軟件BandScan 5.0分析蛋白帶的總灰度，以相對(duì)灰度值表示，將1拷貝轉(zhuǎn)化子的重組蛋白灰度值設(shè)為100。

1.2.3 重組菌誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響

將成功表達(dá)重組蛋白的酵母菌株于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)600至2–6，8 000 r/min離心5 min收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)移至BMMY培養(yǎng)基中，以相同的菌密度，30 ℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d，期間每隔24 h取樣，并補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5%，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。取 15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE，利用凝膠圖像分析軟件 BandScan 5.0對(duì)重組蛋白的總灰度進(jìn)行分析，以相對(duì)灰度值表示，誘導(dǎo)培養(yǎng)1 d的蛋白的灰度值設(shè)為100。

1.2.4 發(fā)酵pH、甲醇添加量、接種量對(duì)重組菌表達(dá)效果的影響

參照1.2.3培養(yǎng)方法，考察誘導(dǎo)pH (將誘導(dǎo)培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，并在培養(yǎng)過(guò)程中添加少量酸堿使發(fā)酵液pH基本保持不變)、甲醇添加量 (甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.6%的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h分別補(bǔ)甲醇至初始濃度)、接種量 (初始接種量分別設(shè)為2%、4%、6%、8%、10%) 對(duì)蛋白表達(dá)的影響。不同條件下培養(yǎng)3 d后收集上清液，取15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE，比較不同條件下上清液中的蛋白量。

1.2.5 重組蛋白ZEN降解活性測(cè)定

發(fā)酵上清液40 μL、0.5 mg/mL ZEN 40 μL、0.05 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 920 μL，混勻，37 ℃反應(yīng)30 min[15]，加入等體積甲醇終止反應(yīng)，HPLC檢測(cè)ZEN殘留量。酶活力定義：在上述條件下，每毫升發(fā)酵液每分鐘降解1 μg ZEN為1個(gè)活力單位 (U)。在相同反應(yīng)體系下，測(cè)定0、30、60、120 min時(shí)ZEN的降解率。

1.2.6 玉米碴中ZEN的降解

向玉米碴中添加ZEN使其含量為2 mg/kg，用緩沖液將酶液分別稀釋2、5、10倍，按照發(fā)酵液與玉米碴 (∶) 1∶1的比例混合均勻 (即酶液添加量分別為0.1、0.2、0.5 mL/g)，37 ℃反應(yīng)0、3、6、12、24 h，不加酶液作為對(duì)照。按照國(guó)標(biāo)GB/T 23504-2009[26]提取樣品中的ZEN，HPLC檢測(cè)ZEN的殘留量。

1.2.7 ZEN的HPLC檢測(cè)條件

高效液相色譜采用C18色譜柱 (4.6 mm× 150 mm，5 μm)、熒光檢測(cè)器 2475型，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水 (60∶40，∶)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用DPS3.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因密碼子優(yōu)化

-6基因按.偏好密碼子優(yōu)化，GC含量為49.9%，密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI) 為0.81，和α信號(hào)肽編碼序列整體 (α--6) 化學(xué)合成 (圖1)。

圖1 zlhy-6基因優(yōu)化序列

2.2 單拷貝表達(dá)載體構(gòu)建

將合成的--6片段質(zhì)粒用Ⅰ/RⅠ酶切，電泳回收基因片段；pAO815質(zhì)粒用RⅠ酶切、CIP去磷酸化，將基因片段和載體按摩爾比3∶1–5∶1用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10感受態(tài)，提取質(zhì)粒，測(cè)序，獲得插入方向正確的pAO815--6表達(dá)載體 (圖2)。

2.3 多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將連接到pGM-T上的表達(dá)框用HⅠ與Ⅱ雙酶切回收，與表達(dá)質(zhì)粒pAO---6連接，轉(zhuǎn)化，獲得2拷貝表達(dá)載體pAO-(--6)2；再將2拷貝表達(dá)載體用HⅠ/Ⅱ雙酶切，回收2拷貝表達(dá)框，與2拷貝表達(dá)框骨架酶連，得到4拷貝表達(dá)載體pAO-(--6)4；再將2拷貝表達(dá)框與 4拷貝表達(dá)載體骨架酶連，得到6拷貝表達(dá)載體pAO-(--6)6?？蛰d體、1拷貝、2拷貝、4拷貝、6拷貝表達(dá)載體分別為7.8 kb、8.8 kb、11.1 kb、 15.8 kb、20.5 kb，經(jīng)HⅠ酶切電泳結(jié)果如圖2A所示，隨拷貝數(shù)的增加其分子量遞增，Ⅱ/HⅠ雙酶切結(jié)果如圖2B所示，1拷貝質(zhì)粒產(chǎn)生約4.0 kb (含組氨酸編碼序列)、2.4 kb (含抗氨芐青霉素編碼序列)及2.35 kb (單拷貝表達(dá)框5′AOX---6-3′AOX-TT3′) 3個(gè)片段 (單拷貝表達(dá)框與抗氨芐序列大小相當(dāng)，電泳分不開(kāi)，兩片段重疊)，2、4、6拷貝重組質(zhì)粒分別出現(xiàn)4.7 kb、 9.4 kb和14.1 kb的片段，表明多拷貝表達(dá)盒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 玉米赤霉烯酮降解酶重組酵母菌株的構(gòu)建及鑒定

將表達(dá)質(zhì)粒用Ⅰ線性化，電擊轉(zhuǎn)化.GS 115感受態(tài)細(xì)胞，從MD篩選平板上隨機(jī)挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化子用BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)，用0.5%甲醇誘導(dǎo)5 d，用SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明1–6拷貝重組菌在分子量30 kDa附近均有一條蛋白帶，而空載體pAO815重組酵母菌株無(wú)目標(biāo)帶 (圖3)。經(jīng)MS-MS分析，該蛋白的分子量為28.9 kDa，與理論分子量 (28.92 kDa) 一致，說(shuō)明1–6拷貝玉米赤霉烯酮降解酶重組酵母菌構(gòu)建成功。

圖2 多拷貝表達(dá)載體酶切電泳分析圖

圖3 重組酵母的篩選

2.5 拷貝數(shù)對(duì)重組蛋白表達(dá)水平的影響

從不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子中各選出1株表達(dá)量高的菌株，采用相同菌濃度用 BMMY培養(yǎng)基30 ℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d (每24 h補(bǔ)加0.5% 甲醇)，用SDS-PAGE分析上清液中的蛋白。結(jié)果表明4拷貝菌株表達(dá)量最高，約為單拷貝轉(zhuǎn)化子的3.4倍 (圖4)。

2.6 重組菌表達(dá)蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間

取4拷貝的重組菌用BMMY培養(yǎng)基30 ℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d，每24 h補(bǔ)加0.5%甲醇，24 h即產(chǎn)生可觀的蛋白，第3天表達(dá)量達(dá)到最高 (灰度值達(dá)142.43%)，此后，重組蛋白又逐漸降低，第5天降至122.49% (圖5)，結(jié)果表明最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d，超過(guò)3 d重組蛋白會(huì)發(fā)生降解。

2.7 pH、甲醇添加量、接種量對(duì)重組菌表達(dá)效果的影響

pH、甲醇添加量、接種量對(duì)4拷貝重組菌蛋白表達(dá)效果的影響如圖6所示。當(dāng)pH為4.5–5.0時(shí)，蛋白表達(dá)量較高，而在其他pH條件下，表達(dá)量很低甚至幾乎不表達(dá)。甲醇濃度在0.6%–1.2%時(shí)，蛋白均能得到較高的表達(dá)量，其中0.8%的甲醇濃度最佳。接種量在2%–10%范圍時(shí)，隨著接種量的增加表達(dá)量有所增加，當(dāng)接種量達(dá)到10%時(shí)，表達(dá)量最高。

圖4 拷貝數(shù)對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌株蛋白表達(dá)的影響

圖6 pH、甲醇添加量及接種量對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

2.8 發(fā)酵液ZEN降解活性

重組菌酵母菌株經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，1拷貝、 2拷貝、4拷貝、6拷貝轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液ZEN降解活性分別為3.0、6.0、10、6.0 U/mL，結(jié)果與轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)量一致 (圖4)。酶解時(shí)間曲線表明反應(yīng)1 h體系中ZEN降解99%以上，而空質(zhì)粒對(duì)照菌株的發(fā)酵液無(wú)ZEN降解 (圖7)。劉海燕等[15]在檢測(cè)重組酶活性時(shí)，在1 mL反應(yīng)體系中添加 980 μL上清液 (ZEN終濃度20 μg/mL)，反應(yīng)2 h ZEN明顯降解；在相同條件下，本研究只添加了2/49的發(fā)酵上清液，作用1 h ZEN就被有效降解，表明本研究所構(gòu)建的多拷貝菌株發(fā)酵液酶活性大約是他們報(bào)道[15]的49倍。

2.9 玉米碴中ZEN的降解

不少酶制劑作為添加劑應(yīng)用于食品、飼料中，如溶菌酶、植酸酶等。但是ZEN降解酶在食品飼料中應(yīng)用的報(bào)道還較少，因此本試驗(yàn)用酶發(fā)酵液對(duì)含ZEN (2 mg/kg) 的玉米碴進(jìn)行處理，初步考察其在飼料中的降解效果。玉米碴中酶液的添加量分別設(shè)為0.1、0.2和0.5 mL/g。結(jié)果如圖8所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，樣品中ZEN含量逐漸降低，反應(yīng)前6 h降解速率較快，6 h以后降解速率趨于平緩。酶的添加量越高降解速率越快，降解率也越高。當(dāng)酶的添加量為0.1 mL/g時(shí)，反應(yīng)6 h，ZEN的降解率僅為14.28%，反應(yīng)24 h后，ZEN的降解率為44.08%。當(dāng)酶的添加量為0.5 mL/g時(shí)，處理6 h，ZEN的降解率即達(dá)到64.29%，處理24 h，玉米碴中ZEN的降解率為75.51%。數(shù)據(jù)表明，該酶對(duì)玉米碴中ZEN有較好的降解效果。

圖7 重組菌發(fā)酵上清液降解ZEN時(shí)間進(jìn)程

圖8 玉米碴中ZEN降解時(shí)間進(jìn)程

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)玉米赤霉烯酮降解酶基因序列zlhy-6按照畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，與α-信號(hào)肽編碼序列整體合成，并用pAO815質(zhì)粒構(gòu)建了多拷貝表達(dá)載體，將其電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株，獲得ZEN降解酶高效分泌表達(dá)重組菌。重組蛋白分子量為28.9 kDa，與理論值一致。重組菌誘導(dǎo)發(fā)酵3 d，蛋白帶濃度達(dá)最高，之后下降；在pH 5.0、4.5條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)量最高，其他pH表達(dá)量很少；每天添加0.8%的甲醇、接種量10%表達(dá)水平最高；4拷貝的轉(zhuǎn)化子蛋白表達(dá)水平最高，發(fā)酵3 d，酶活性達(dá)到10 U/mL，約是文獻(xiàn)[15]報(bào)道的49倍。在1 g玉米碴中添加0.1– 0.5 mL發(fā)酵上清液，水解24 h，ZEN的降解率為44.08%–75.51%。

本研究結(jié)果為提高ZEN降解酶工業(yè)發(fā)酵水平及酶的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)，也為該酶用于降解食品飼料中的ZEN提供一定的理論參考。但是，該酶的最適作用pH為8.5，最適反應(yīng)溫度為37 ℃[25]，而食品、飼料的pH一般為中性偏酸性，消化道中的pH更低，此外，該酶不耐熱，在生產(chǎn)和應(yīng)用時(shí)酶活性會(huì)降低，所以，有必要通過(guò)一定手段，如定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化、結(jié)構(gòu)延伸突變、糖基化修飾及雜合酶等方法降低酶的最適pH、提高酶的熱穩(wěn)定性，從而改善酶的性質(zhì)，促進(jìn)ZEN降解酶在食品、飼料中的應(yīng)用。

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High expression of zearalenone degrading enzyme in

Yichun Wang, Yan Wang, Junping Jiang, Yueju Zhao, Fuguo Xing, and Lu Zhou

,,&,,100193,

High expression of zearalenone (ZEN) degrading enzyme gene (6) instrain GS115 was achieved by codon optimization and multi-copy construction. The codon-optimized zlhy-6 gene sequence was synthesized with the alpha factor signal peptide coding sequence and inserted into the pAO815 plasmid. The expression plasmid containing 1–6 expression cassettes was constructed by enzyme digestion and transferred intoGS115 strain to obtain the ZEN degrading enzyme recombinant strain. The molecular weight of the recombinant protein was 28.9 kDa, which was consistent with the theoretical value. After 3 days of induction fermentation, the protein concentration reached the highest level and then decreased; the expression level was the highest in the induction culture at pH 5.0 and 4.5, while the expression level at other pH was very low; the expression level was the highest when 0.8% methanol was added every day and 10% inoculation was added; the expression level of four-copy transformants was the highest, and the enzyme activity reached 10 U/mL after 3 days of flask fermentation, The degradation rate of ZEN in 1 g corn ballast was 44.08%–75.51% when 0.1–0.5 mL fermentation supernatant added and hydrolyzed for 24 hours. The results of this study laid a foundation for improving the industrial fermentation level of ZEN degrading enzyme and its application in eliminating ZEN in food and feed.

zearalenone, degradation,6, high-level expression, multi-copies,

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Wang YC, Wang Y, Jiang JP, et al. High expression of zearalenone degrading enzyme in. Chin J Biotech, 2020, 36(2): 372–380.

April 20, 2019;

August23, 2019

Supported by:Research Project of Institute of Food Science & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences (No. S2017JC02),Beijing Municipal Natural Science Foundation (No. 5083025), Beijing Food and Economic Crop Industry Innovation Team(No. BAIC09-2018).

Junping Jiang. Tel: +86-10-62810295; E-mail: 1367858907@qq.com

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi) (No. S2017JC02)，北京市自然科學(xué)基金 (No. 5083025)，北京市糧經(jīng)作物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金 (No. BAIC09-2018) 資助。

10.13345/j.cjb.190150

(本文責(zé)編 郝麗芳)