陳才，陳偉，鄭堯，顧浩，王偉，王宵燕，高波，宋成義

·動物及獸醫(yī)生物技術·

轉(zhuǎn)座子引起的豬基因結(jié)構(gòu)變異及其與生產(chǎn)性能的關聯(lián)分析

陳才，陳偉，鄭堯，顧浩，王偉，王宵燕，高波，宋成義

揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009

為探明轉(zhuǎn)座子對豬的基因及其側(cè)翼區(qū)結(jié)構(gòu)變異的貢獻，從全基因組測序(WGS) 數(shù)據(jù)庫中獲取 14個豬基因組中的基因序列和側(cè)翼序列，通過ClustalX多序列比對和RepeatMasker轉(zhuǎn)座子注釋，全面解析轉(zhuǎn)座子對的影響。通過PCR檢測到一個SINEA1轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)，在蘇姜豬群體中與相關性狀進行關聯(lián)分析。結(jié)果顯示，基因及其側(cè)翼區(qū)中含有至少77個轉(zhuǎn)座子片段，其中絕大部分 (98.70%) 為SINE類轉(zhuǎn)座子，并鑒定到9個小結(jié)構(gòu)變異和4個由轉(zhuǎn)座子引起的大結(jié)構(gòu)變異，表明轉(zhuǎn)座子是基因變異的重要來源。其中一個SINEA1插入多態(tài)引起的結(jié)構(gòu)變異，在不同品種中呈現(xiàn)豐富的多態(tài)性，且無插入個體 (SINE-/-) 蘇姜豬的斷奶窩重 ((64.20±10.6) kg) 比純合有插入個體 (SINE+/+) ((74.14±9.0) kg) 和雜合有插入個體 (SINE+/-) ((69.71±7.7) kg) 輕 (<0.05)，表明基于轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)研發(fā)分子標記具有可行性，提示轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)分子標記在分子輔助育種中具有較強的應用潛力。

轉(zhuǎn)座子，插入多態(tài)，結(jié)構(gòu)變異，基因關聯(lián)分析

在豬基因組中，轉(zhuǎn)座子是基因組的主要組成成分，占豬基因組的40.72%，其中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是主要成分，占轉(zhuǎn)座子的91.49%[1]。研究表明，轉(zhuǎn)座子是基因組大小的重要決定因素，基因組的大小與其轉(zhuǎn)座子的含量成正相關[2]。同時轉(zhuǎn)座子可移動的特性使其成為基因組結(jié)構(gòu)變異的重要貢獻者，并在多個水平上影響宿主基因的活性。已有超過100例反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子介導的插入導致了人類遺傳疾病的報道[3]。同時在動物上已經(jīng)觀察到許多由轉(zhuǎn)座子插入引起的表型變化，例如短散在核元件 (Short interspersed nuclear elements，SINE) 插入引起狗的體型變化和毛色變化[4-6]，以及內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒 (Endogenous retroviruses transposon，ERV) 插入引起雞的蛋殼顏色變化[7]。在豬中也觀察到兩例因L1插入引起的性狀變化[8-9]。

驅(qū)動連接蛋白基因 (，) 產(chǎn)物是生物進化過程中保留下來的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種保守性膜受體蛋白。豬 ()基因 (GeneID: 100152397) 位于Chr1: 184 881 555–184 990 936 (+) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100152397)，全長109 382 bp。于1992年從雞胚腦的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)[10]，其后有研究表明該基因與雞脛骨軟骨病有關[11]。同時，在人的疾病研究中，通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了在皮膚鱗狀細胞癌 (cSCC) 中發(fā)揮重要作用，并可作為治療干預的新靶點[12]。

目前對豬基因的研究較少，而豬的基因及其側(cè)翼序列中轉(zhuǎn)座子及結(jié)構(gòu)變異 (Structural variations，SV) 的分布情況還未見報道。因此全面解析基因中存在的結(jié)構(gòu)變異，揭示轉(zhuǎn)座子對其結(jié)構(gòu)變異的貢獻非常必要，其研究結(jié)果將會對進一步理解轉(zhuǎn)座子對功能基因的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究所用動物樣品為大白豬 (pig) 耳樣62個，來自安徽省某種豬育種公司 (安徽省)；長白豬 (pig) 抗凝血樣30個和杜洛克 (pig) 抗凝血樣30個，來自徐州六馬種豬科技有限公司 (江蘇省)；梅山豬 (pig) 耳樣30個和二花臉 (pig) 耳樣 41個，來自蘇州蘇太企業(yè)有限公司 (江蘇省)；巴馬香豬 (pig)耳樣20個，來自巴馬原種香豬農(nóng)牧實業(yè)有限公司 (廣西省)；蘇姜豬 (pig) 耳樣184個，來自姜曲海種豬場 (江蘇省)；藏豬 (pig) 耳樣36個，來自甘孜市畜牧所采集自四川省康定市地區(qū) (四川省)。野豬 () 肉樣3頭，采購自安徽地區(qū)。

1.2 基因組提取

使用試劑盒TaKaRa的MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 (TaKaRa，大連，中國) 從血液或耳組織中提取基因組DNA。提取的基因組DNA通過紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行DNA濃度和質(zhì)量檢測，然后置于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 獲取ktn1基因和側(cè)翼序列

從NCBI數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/?term=100152397) 中定位基因的位置，向其5′側(cè)翼區(qū)和3′側(cè)翼區(qū)分別延伸5 kb和3 kb作為參考序列。利用參考序列與NCBI的WGS數(shù)據(jù)庫中的基因組序列數(shù)據(jù)進行比對，獲取到另外13個基因組序列中基因及側(cè)翼區(qū)的序列，其中部分基因組中的序列由于數(shù)據(jù)庫中基因組測序數(shù)據(jù)拼接長度不夠，需要手動拼接。

1.4 豬ktn1基因在不同物種間的保守性分析

為了分析(基因和側(cè)翼區(qū)) 序列的保守性，將豬(基因和側(cè)翼區(qū)) 序列定位于ENSEMBL數(shù)據(jù)庫 (http://www.ensembl.org/index. html) 中的豬參考基因組上，同時進行區(qū)域比對 (Region Comparison)，獲取牛、綿羊、馬、人、小鼠、狗參考基因組中相對應的序列，然后使用mVISTA (http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml)進行保守分析。

1.5 轉(zhuǎn)座子注解

通過使用RepeatMasker (version：4.0.7，-cutoff 250，-nolow)結(jié)合本實驗室構(gòu)建的豬轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫[1]對杜洛克參考基因組的(基因和側(cè)翼區(qū)) 序列進行轉(zhuǎn)座子注釋，僅保留比對得分超過1 000且標記長度超過100 bp的位點進行后續(xù)分析。

1.6 ktn1基因多序列比對及結(jié)構(gòu)突變分析

將14條(基因和側(cè)翼區(qū)) 序列使用ClustalX (version：2.0) 軟件進行多序列比對以鑒定結(jié)構(gòu)突變。我們定義2–10 bp的變異為小型結(jié)構(gòu)變異，且僅當有3個及以上品種基因組數(shù)據(jù)中出現(xiàn)一致變異才被認定為確定存在的變異，少于3個品種發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異被認為可能由測序或拼接不準造成的不確定變異，未被統(tǒng)計。大于50 bp的變異被定為大結(jié)構(gòu)變異，且僅當2個及以上品種基因組數(shù)據(jù)中出現(xiàn)時才被統(tǒng)計，但由測序不確定 (如超過500 bp的gap或超過100 bp的N) 造成的大結(jié)構(gòu)變異未被統(tǒng)計。同時將大結(jié)構(gòu)變異與1.5中轉(zhuǎn)座子注釋位點進行相互對應，超過60%長度的結(jié)構(gòu)變異對應轉(zhuǎn)座子標記位點的被認定為是由轉(zhuǎn)座子引起的結(jié)構(gòu)變異。

1.7 ktn1中SINE轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)檢測

選擇一個中年輕SINE轉(zhuǎn)座子插入位點兩側(cè)的序列使用Oligo7設計常規(guī)PCR引物，引物名稱及序列信息見表1。同時選取杜洛克豬、長白豬、大白豬、野豬、梅山豬、藏豬、二花臉豬、巴馬香豬8個品種，每個品種3個個體進行插入多態(tài)性檢測。

1.8 ktn1中SINE插入多態(tài)位點群體檢測

對1.7中SINE插入位點在不同品種的群體中 (大白豬 62頭、長白豬48頭、杜洛克44頭、蘇姜豬184頭、巴馬香豬36頭)插入多態(tài)性及其頻率進行檢測。計算基因型頻率、等位基因頻率。對基因型分布進行 Hardy-Weiberg平衡的卡方適合性檢驗 (chi-square test)：

(Observed) 代表每個基因型的觀測數(shù)目，(Expected) 代表每一個基因型在哈代-溫伯格平衡定律成立的假定下的期望數(shù)目。同時在蘇姜豬中與相關生長繁殖性狀進行關聯(lián)分析，使用SPSS通過Duncan測驗進行差異顯著性分析 (<0.05)。

表1 豬ktn1基因中SINE轉(zhuǎn)座子插入位點檢測引物

2 結(jié)果與分析

2.1 獲取到14條ktn1基因的序列

經(jīng)過與NCBI的WGS數(shù)據(jù)庫中不同品種的豬基因組測序數(shù)據(jù)比對，獲取到14個測序基因組中(基因及上游5 kb和下游3 kb側(cè)翼區(qū)) 的序列，序列的來源及在各基因組中的長度見表2。從不同品種的測序基因組中獲取到的(基因及側(cè)翼區(qū)) 長度存在一定的差異，八眉豬 (pig)、長白豬 (pig) 和大白豬 (pig) 中獲取的序列長度與杜洛克豬 (pig) 參考序列長度相近 (117 382 bp)，在雜交豬 (pig)、哥根廷豬 (pig)、金華豬 (pig) 和榮昌豬 (pig) 中，序列長度略小于參考序列，但在五指山豬 (pig) 和巴克夏豬 (pig) 的基因組中獲取的序列明顯短于參考序列，分別只有115 708 bp和114 968 bp，提示在基因或其側(cè)翼區(qū)中存在結(jié)構(gòu)變異。

2.2 ktn1基因在不同物種中相對比較保守

根據(jù)NCBI對豬基因的注解，基因的長度為109 382 bp，共有54個外顯子，但前6個外顯子只是起始位置不同，結(jié)束位置相同，而最后4個外顯子的起始位置相同，終止位置不同。這些外顯子通過不同的拼接組合形成15個轉(zhuǎn)錄本 (圖1)。

通過mVISTA將豬(基因和側(cè)翼)與牛、綿羊、馬、狗、人、小鼠中相應區(qū)域的序列進行保守性分析。結(jié)果如圖1所示，豬的基因與牛、綿羊、狗和馬的保守性較高，其次是人，與小鼠的保守性最差。但在上述7個物種中外顯子區(qū)尤其CDS區(qū) (淺紫色)均非常保守，而第一內(nèi)含子區(qū)保守性相對較弱。

2.3 杜洛克參考基因組中轉(zhuǎn)座子對ktn1基因的貢獻

由于杜洛克參考基因組中基因序列最為完整，因此以杜洛克中基因的轉(zhuǎn)座子注解信息進行統(tǒng)計分析，在基因及其側(cè)翼區(qū)中鑒定到77個轉(zhuǎn)座子標記位點，其中76個為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 (98.70%)，其中SINE最多，有54個位點，最年輕的家族SINEA有49個位點。對標記長度進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，117 382 bp的(基因和側(cè)翼) 序列中共有26 364 bp (22.46%) 被轉(zhuǎn)座子標記，其中最多是SINE (13 638/11.62%)，其次是LINE (11 328/9.65%)，其中最年輕SINE家族SINEA標記了12 588 bp占10.72%?；蛑修D(zhuǎn)座子數(shù)量及序列貢獻信息見表3。

表2 不同豬種的基因組中ktn1(基因及上游5 kb和下游3 kb側(cè)翼區(qū))序列來源和長度

圖1 ktn1基因保守性分析及轉(zhuǎn)錄本示意圖

表3 杜洛克參考基因組中ktn1基因中轉(zhuǎn)座子數(shù)量及序列貢獻信息

2.4 ktn1基因中存在多個結(jié)構(gòu)突變

將14條(基因和側(cè)翼區(qū)) 序列進行多序列比對，統(tǒng)計結(jié)構(gòu)突變位點。外顯子區(qū)未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異。在5′側(cè)翼區(qū)和3′側(cè)翼區(qū)各找到1個小結(jié)構(gòu)突變，在內(nèi)含子區(qū)找到7個小結(jié)構(gòu)變異。而在基因的內(nèi)含子區(qū)，只發(fā)現(xiàn)4個超過50 bp的大結(jié)構(gòu)變異。具體數(shù)據(jù)及統(tǒng)計條件見表4，其中較大的 4個結(jié)構(gòu)突變?nèi)繉D(zhuǎn)座子注釋位點。

2.5 ktn1-STIP轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)性驗證

在8個不同豬品種 (杜洛克、長白豬、大白豬、野豬、梅山豬、藏豬、二花臉、巴馬香豬)的24個個體中對基因上的一個SINEA1轉(zhuǎn)座子插入位點 (表4中的B位點) 的多態(tài)性進行檢測，該位點在8個品種的24個個體中呈現(xiàn)出良好的多態(tài)現(xiàn)象，且檢測結(jié)果清晰易判斷 (圖2)。此位點在基因上的位置以紅色箭頭標注在圖1中，其插入方向與基因相反，位于基因的內(nèi)含子區(qū)域 (圖1)，未影響基因的編碼區(qū)。由電泳圖 (圖2)可以看出，該分子標記在豬群體中有3種基因型，SINE插入純合基因型 (SINE+/+)，為單條大帶676 bp，SINE無插入純合基因型 (SINE-/-)，為單條小帶381 bp，SINE插入雜合基因型 (SINE+/-)，為兩條帶676 bp和 381 bp。

表4 ktn1基因及其側(cè)翼區(qū) (5 kb 5′和3 kb 3′側(cè)翼區(qū)) 結(jié)構(gòu)突變信息

圖2 ktn1-STIP位點在8個品種中多態(tài)檢測結(jié)果

2.6 ktn1-STIP與斷奶窩重呈顯著性相關

將-STIP在62個大白個體、48個長白豬個體、44個杜洛克個體、36個巴馬香豬個體和184個蘇姜豬個體中進行多態(tài)檢測。由圖3可以看出，該位點的SINE在本研究群體中均呈現(xiàn)出插入多態(tài)現(xiàn)象。對插入基因型進行統(tǒng)計，結(jié)果見表5，大白豬和長白豬的基因型SINE+/+的頻率高于杜洛克豬、蘇姜豬和巴馬豬。而杜洛克豬和巴馬香豬中SINE–/–的個體明顯多于另外兩種基因型。

選取-STIP在蘇姜豬豬群體中 (184) 進行多態(tài)性檢測，并將每個個體的生長繁殖性狀與-STIP位點的多態(tài)性進行關聯(lián)分析，結(jié)果顯示，在蘇姜豬中斷奶窩重與基因中是否有SINE插入顯著相關 (<0.05)，無插入個體 (SINE-/-) 斷奶窩重 ((64.20±10.6) kg) 比純合有插入個體 (SINE+/+) ((74.14±9.0) kg) 和雜合有插入個體 (SINE+/-) ((69.71±7.7) kg) 輕。產(chǎn)活仔數(shù)、斷奶仔豬數(shù)和初生窩重與基因中-STIP位點是否有SINE插入無顯著相關性 (表6)。

圖3 ktn1-STIP位點大白豬、蘇姜豬、長白豬、巴馬香豬和杜洛克豬群體中多態(tài)性檢測代表電泳圖。

表5 豬ktn1基因型多態(tài)性分析

Note: χ20.05(df=1)=3.84, χ20.01(df=1)=6.63.

表6 ktn1-STIP插入多態(tài)與生長繁殖性狀關聯(lián)分析

Note: identical letters in the same column indicates no significant difference; different letters indicate significant differences (<0.05).

3 討論

盡管SINE僅占豬基因組的8%左右，但它們廣泛分布在整個基因組中[13-14]，已經(jīng)有研究證明一些SINE插入與豬生長、繁殖和胴體性狀顯著相關[15-16]。SINE可以在多個水平上影響基因活性或功能 (基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和翻譯等)。在某些情況下SINE可作為順式調(diào)控元件參與基因表達調(diào)控，如多腺苷酸化和選擇性剪接的過程[17-18]。此外，SINE RNA還可以作為反式調(diào)控因子調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[17,19]。本研究通過對(基因和側(cè)翼區(qū)) 序列進行轉(zhuǎn)座子注釋，發(fā)現(xiàn)僅在杜洛克參考基因組中的基因及其側(cè)翼區(qū)中就含有77個轉(zhuǎn)座子片段，絕大部分為SINE類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，有49個插入，這說明，轉(zhuǎn)座子對的結(jié)構(gòu)和序列組成具有重要的影響，值得進一步探究。進一步對14個不同豬品種/品系的基因組中的(基因和側(cè)翼區(qū)) 序列進行比對，發(fā)現(xiàn)了9個小結(jié)構(gòu)變異及4個大結(jié)構(gòu)變異，且大結(jié)構(gòu)變異全部由轉(zhuǎn)座子插入引起，其中2個為SINEA1插入引起。這也進一步驗證了之前的研究，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是基因組的主要組成成分，是基因變異的重要來源[1,20-22]。

年輕轉(zhuǎn)座子在不同品種中，存在豐富的插入多態(tài)性[1]，因此通過使用不同品種和個體樣本對每個轉(zhuǎn)座子位點引起的結(jié)構(gòu)變異進行多態(tài)檢測，將會全面揭示轉(zhuǎn)座子對豬基因結(jié)構(gòu)突變的影響。本研究中，我們在基因的內(nèi)含子區(qū)檢測到2個SINEA1插入引起的結(jié)構(gòu)變異，對其中 一個進行插入多態(tài)性檢測，結(jié)果表明，此位點在多個品種中存在插入多態(tài)性 (圖2)，且在大白豬、長白豬中SINEA1的插入頻率 (SINE+) 高于無插入頻率 (SINE-)，而杜洛克、蘇姜豬和巴馬香豬中呈現(xiàn)相反的現(xiàn)象。并且引入豬種大白豬、長白豬和杜洛克豬和培育豬種蘇姜豬偏離哈代溫伯格平衡，巴馬香豬等中國地方豬種符合哈代溫伯格平衡 (表5)，說明被檢測的巴馬香豬群體符合群體基因遺傳平衡，而杜洛克、大白豬、長白豬是經(jīng)過人工選育的西方商品豬，培育豬種蘇姜豬的親本為杜洛克、姜曲海和楓涇，在世代選育過程中造成群體偏離遺傳平衡。

仔豬在哺乳期體重的增加依賴于自身生長發(fā)育潛力和母豬的哺乳能力及營養(yǎng)、環(huán)境因素等。目前研究表明SINE轉(zhuǎn)座子對基因具有多種調(diào)控功能。將184個蘇姜豬個體的生長繁殖性狀與SINE-位點的轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)性進行關聯(lián)分析，顯示SINE轉(zhuǎn)座子的插入可以顯著增加仔豬斷奶窩重，提示豬基因中SINE的插入可能影響了基因的表達，通過一定信號通路，進而影響仔豬生長發(fā)育，或者通過影響母豬泌乳生理機能，間接影響仔豬生長發(fā)育，其具體分子機制值得深入探究。

4 結(jié)論

本研究通過對14條(基因及其側(cè)翼區(qū))序列的多序列比對和轉(zhuǎn)座子注釋，全面解析轉(zhuǎn)座子對的影響。最終在參考基因組的基因及其側(cè)翼區(qū)中鑒定到77個轉(zhuǎn)座子片段，其中絕大部分 (98.70%) 為SINE類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，與基因組中大多數(shù)轉(zhuǎn)座子的分布情況一致。并鑒定到 9個小結(jié)構(gòu)變異和4個由轉(zhuǎn)座子引起的大結(jié)構(gòu)變異，證明了轉(zhuǎn)座子是基因變異的重要來源。進一步檢測了其中一個SINEA1轉(zhuǎn)座子的插入多態(tài)性，并在蘇姜豬群體中與相關性狀進行關聯(lián)分析，結(jié)果表明，無插入個體 (SINE-/-) 的斷奶窩重較純合插入個體 (SINE+/+) 和雜合插入個體 (SINE+/-) 輕 (<0.05)。本研究表明基于轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)研發(fā)分子標記具有可行性，同時此分子標記在分子輔助育種中具有很強的應用潛力。

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Structural variations caused by transposons in porcinegene and their association with production traits

Cai Chen, Wei Chen, Yao Zheng, Hao Gu, Wei Wang, Xiaoyan Wang, Bo Gao, and Chengyi Song

,,225009,,

In order to determine the effect of transposons on the sequence and structural variations of the porcinegene and its flanking regions, we obtained 14sequences (including genic region, 5-kb 5′ flank and 3-kb 3′ flanking regions) from the WGS database in NCBI, multiple sequence alignment by ClustalX and transposon annotation by RepeatMasker. Then we analyzed the effect of transposons on. A SINEA1 insertion polymorphism was detected by PCR, and correlation was analyzed with related traits in thepig population. Thegene and its flanking regions contained at least 77 transposon fragments, the majority (98.70%) of which was SINE insertions. We observed 9 small structural variations and 4 large structural variations caused by transposons, indicating that transposons were an important source of genetic variations. One of the structural variations caused by SINEA1 insertion polymorphism showed rich polymorphism in different breeds, and inpigs, the weaned litter weight of non-inserted individuals (SINE-/-) ((64.20±10.6) kg) was lighter than homozygous insertionindividuals (SINE+/+) ((74.14±9.0) kg) and heterozygous insertion individuals (SINE+/-) ((69.71±7.7) kg) (<0.05). It is feasible to develop molecular marker based on the transposon insertion polymorphism to provide application potential in molecular-assisted breeding.

transposon, insertion polymorphism, structural variations,gene, association analysis

陳才, 陳偉, 鄭堯, 等. 轉(zhuǎn)座子引起的豬基因結(jié)構(gòu)變異及其與生產(chǎn)性能的關聯(lián)分析. 生物工程學報, 2020, 36(2): 267–275.

Chen C, Chen W, Zheng Y, et al. Structural variations caused by transposons in porcinegene and their association with production traits. Chin J Biotech, 2020, 36(2): 267–275.

May 9, 2019;

July 10, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31572364, 31872977).

Chengyi Song. Tel: +86-514-87979034; E-mail: cysong@yzu.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos. 31572364, 31872977) 資助。

10.13345/j.cjb.190179

(本文責編 陳宏宇)