徐瑤，吳濤，郭美錦，莊英萍，王得明，樊樂

·工業(yè)生物技術(shù)·

氮源對阿維菌素合成的影響及基于二氧化碳釋放速率的阿維菌素發(fā)酵調(diào)控

徐瑤1，吳濤1，郭美錦1，莊英萍1，王得明2，樊樂2

1 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2 齊魯制藥 (內(nèi)蒙古) 有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000

中國是世界上最大的也是唯一的阿維菌素原料生產(chǎn)國，但在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中與同類型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素相比其產(chǎn)量相對偏低。文中通過研究不同氮源對阿維鏈霉菌生長、代謝的影響，發(fā)現(xiàn)氮源在發(fā)酵中后期對菌絲活性、菌絲濃度以及阿維菌素B1a的合成都有較為顯著的影響。在100 L生物反應(yīng)器中，于發(fā)酵中后期基于二氧化碳釋放速率 (CER) 控制補(bǔ)入酵母粉，效價達(dá)到8 697 mg/L，與原工藝相比，提高了26.9%。這一結(jié)論若在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，有望帶來實(shí)際的經(jīng)濟(jì)效益。

阿維鏈霉菌，阿維菌素，酵母粉，二氧化碳釋放速率

阿維菌素(Avermectin，AVM) 是由阿維鏈霉菌生產(chǎn)的一類具有除蟲作用的聚酮類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，被廣泛地運(yùn)用于農(nóng)業(yè)與畜牧業(yè)中殺蟲除螨。阿維菌素有8種天然組分，分別為A1a、A2a、B1a、B2a、A1b、A2b、B2a、B2b，其中B1a的除蟲活性最好，商品阿維菌素中的主要成分是B1a組分。目前，我國已是世界上最大的阿維菌素原料生產(chǎn)國，但普遍存在產(chǎn)量較低、發(fā)酵周期長等問題。自阿維菌素被發(fā)現(xiàn)以來，研究者們對其合成途徑[1-2]以及合成途徑中相關(guān)基因[2-5]進(jìn)行了大量研究，并對阿維菌素產(chǎn)生菌進(jìn)行了基因工程改造。誘變育種的方法也廣泛地運(yùn)用于提高菌種的生產(chǎn)能力[6-8]。除了從基因?qū)用鎸Π⒕S鏈霉菌進(jìn)行改造提高阿維菌素的產(chǎn)素能力，研究者們也試圖通過對發(fā)酵過程的精準(zhǔn)調(diào)控實(shí)現(xiàn)提高產(chǎn)量的目的，開發(fā)了一系列基于殘?zhí)荹9]、pH、攝氧率(Oxygen uptake rate，OUR)[10-11]、乙醇合成速率[12]等控制補(bǔ)糖的發(fā)酵過程調(diào)控策略，達(dá)到提高產(chǎn)物合成目的。

阿維鏈霉菌是一種絲狀菌，培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、反應(yīng)器供氧都會對菌絲形態(tài)造成較大的影響，菌絲形態(tài)也會在一定程度上影響產(chǎn)物B1a的合成。菌體生長與產(chǎn)物合成都伴隨著攝氧率 (OUR) 與二氧化碳釋放速率 (CER) 的變化，在參數(shù)相關(guān)分析中可以根據(jù)OUR、CER、溶解氧 (DO)、pH等參數(shù)的相關(guān)關(guān)系判斷菌體所處的不同代謝階段、菌體活性等信息。目前，在阿維菌素發(fā)酵過程補(bǔ)料控制中主要通過控制發(fā)酵中后期補(bǔ)糖時間以及補(bǔ)糖量來提高阿維菌產(chǎn)量，梁劍光等[11]基于在線OUR補(bǔ)加葡萄糖，在130 m3工業(yè)規(guī)模上將阿維菌素產(chǎn)量提高到5 228 mg/L；樊樂[13]通過過程補(bǔ)加淀粉液化液將殘?zhí)强刂圃谳^高水平，成功地將阿維菌素效價提高到6 530 mg/L。陳凝等在對阿維鏈霉菌形態(tài)對產(chǎn)物合成的影響中發(fā)現(xiàn)阿維菌素發(fā)酵過程中維持菌球尺寸大小有利于產(chǎn)物的合成[14]，酵母粉等有機(jī)氮源中的氮源物質(zhì)、微量元素以及少量生長因子有利于維持菌體活性。本研究在發(fā)酵過程基于殘?zhí)茄a(bǔ)糖工藝的基礎(chǔ)上，主要探究的是不同氮源對產(chǎn)物合成的影響，找到合適的氮源用于后期補(bǔ)料，以期達(dá)到提高B1a產(chǎn)量的目的；與OUR相比，CER主要涉及到呼吸代謝中碳平衡，與所利用的碳源的還原度關(guān)系不大，所以本研究利用CER的變化與菌體活性變化具有相關(guān)性特點(diǎn)，在發(fā)酵過程中基于CER進(jìn)行補(bǔ)料調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿維鏈霉菌82由齊魯制藥 (內(nèi)蒙古) 有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉4 g/L，酵母浸粉3 g/L，麥芽浸粉10 g/L，CoCl2·6H2O 5 mg/L，瓊脂20 g/L，pH 7.3。

搖瓶種子培養(yǎng)基：玉米淀粉30 g/L，黃豆餅粉8 g/L，花生餅粉10 g/L，酵母浸粉4 g/L，CoCl2·6H2O 0.03g/L，α-淀粉酶 0.04 g/L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉120 g/L，黃豆餅粉28 g/L，酵母粉10 g/L，(NH4)2SO40.25 g/L，CaCO30.8g/L，CoCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO40.022 g/L，MnSO40.002 2 g/L，α-淀粉酶0.1 g/L。

種子罐培養(yǎng)基：玉米淀粉33–40 g/L，豆餅粉8–15 g/L，酵母粉4–6 g/L，酵母膏4–5 g/L，花生餅粉10 g/L，CoCl2·6H2O 0.03 g/L，有機(jī)硅0.42 g/L，GPE 0.42 g/L。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基：玉米淀粉155–160 g/L，豆餅粉26–30 g/L，酵母粉11–13 g/L，(NH4)2SO40.4 g/L，CaCO31.1 g/L，CoCl2·6H2O 0.024 g/L，NaMoO40.027g/L，MnSO40.001 9 g/L，α-淀粉酶 0.4 g/L，有機(jī)硅0.16 g/L，GPE 0.16 g/L。

1.2 測定方法

效價測定：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵液1.00 g，加無水甲醇15 mL，置于超聲波清洗儀中超聲萃取30 min，離心過濾取濾液用HPLC法測定B1a效價。色譜條件：Agilent高效液相色譜儀；C18柱；流動相甲醇︰水 (/)=9︰1；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 20 μL；檢測波長 245 nm。

壓縮體積比 (Packed mass volume，PMV) 測定：采用離心法計算，取10 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，計算固體物質(zhì)所占比例。

總糖與還原糖的測定：采用DNS法；氨基氮測定采用甲醛滴定法；溶磷測定采用鉬酸銨分光光度法。

黏度測定采用NDJ-8S型數(shù)字黏度計測定；葡萄糖測定采用SGD-IV型測糖儀測定。

1.3 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：取200 μL經(jīng)過快速解凍的甘油管保藏的孢子懸液于裝有固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，涂布均勻，于28 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7 d。

種瓶培養(yǎng)：采用斜面挖塊接種，用無菌鏟從孢子已經(jīng)成熟的斜面上挖取1 cm2大小菌苔接種到種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、240 r/min培養(yǎng)36–40 h。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：按照5%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、240 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)10 d。

100 L反應(yīng)器發(fā)酵培養(yǎng)：種子罐為50 L反應(yīng)器，發(fā)酵罐為100 L反應(yīng)器 (反應(yīng)器為上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司產(chǎn)品，配備控制系統(tǒng)、尾氣分析系統(tǒng)以及具備數(shù)據(jù)采集與分析功能的BIOSTAR軟件包)，其裝液量分別為25 L和50 L；發(fā)酵罐接種量為10%，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)周期330 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對阿維菌素生物合成的影響

酵母粉、酵母膏、玉米漿以及硫酸銨是在微生物發(fā)酵工業(yè)中常使用的幾種速效氮源，其中酵母膏是酵母細(xì)胞經(jīng)過破壁水解之后的產(chǎn)物，所以其營養(yǎng)成分相對酵母粉要更加豐富也更加便于利用?？疾炝私湍阜?、酵母膏、玉米漿以及少量無機(jī)氮源硫酸銨對阿維菌素B1a生物合成的影響。

對比分析酵母粉、酵母膏、玉米漿以及硫酸銨這4種物質(zhì)作為氮源時，過程PMV、總糖、溶磷、氨基氮、B1a變化如圖1 (A、B、C、D、E)所示，從圖中可以看出以酵母膏作為主要氮源的實(shí)驗(yàn)組在初級生長階段48 h之前菌體量迅速上升，期間伴隨著總糖的快速消耗以及氨基氮和溶磷的快速下降，到48 h PMV明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，其PMV達(dá)到55%，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，72 h之后，PMV開始持續(xù)顯著下降，可能是菌絲前期快速生長會形成菌核相對密實(shí)且大的菌球，此時菌球中心的菌絲因?yàn)閭髻|(zhì)以及傳氧受到限制而自發(fā)裂解，造成PMV的快速下降。由于前期菌體快速生長消耗了大量糖以及氮源物質(zhì)，后期維持菌體代謝依舊需要消耗大量的能源物質(zhì)，所以其后期耗糖量較大，但是產(chǎn)物阿維菌素B1a的合成速率卻不高，大量的碳源都用于維持自身代謝而并非流向產(chǎn)物合成相關(guān)途徑。

以玉米漿和以0.5%硫酸銨替代培養(yǎng)基中的部分酵母粉的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，兩組都在發(fā)酵中后期菌球外菌絲松散脫落，大部分菌球裂解自溶，造成菌濃明顯下降，這些從發(fā)酵中后期氨基氮和溶磷開始回升可以得到驗(yàn)證。在60 h之前，玉米漿組的糖耗與酵母粉組基本一致，最大菌濃也基本一致，但是60 h進(jìn)入產(chǎn)素期以后可以明顯觀察到耗糖速率開始小于酵母粉組并且?guī)缀鯖]有產(chǎn)物的合成，此過程可能是由于玉米漿的部分代謝產(chǎn)物對阿維菌素的生物合成會有一定的影響。當(dāng)用0.5%硫酸銨替代培養(yǎng)基中部分酵母粉之后，整個發(fā)酵過程中耗糖速都明顯低于其他組，特別是在72 h之后，培養(yǎng)基中總糖基本不再下降，同時也幾乎不生產(chǎn)阿維菌素B1a，鄭夢杰等[15]研究了銨根離子對阿維菌素生物合成的影響，其結(jié)果表明在整個發(fā)酵過程中，銨根離子能夠抑制包括淀粉酶以及參與糖代謝相關(guān)酶的活性從而抑制產(chǎn)物的合成。

圖1 不同氮源對PMV (A)、總糖(B)、溶磷(C)、氨基氮(D) 以及B1a (E) 濃度的影響

從結(jié)果來看，以酵母粉作為氮源的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)物合成能力，產(chǎn)素過程中一直保持較快的增長速度。發(fā)酵初期菌絲處于快速生長階段，48 h PMV達(dá)到43%，與酵母膏組相比其最大值較低，但是整個發(fā)酵過程中PMV能夠維持在40%左右，次級代謝階段也能保持相對穩(wěn)定的耗糖速率以及較快的產(chǎn)物合成速率，這可能是由于工業(yè)酵母粉微溶于水，沒有經(jīng)過水解等處理，其中營養(yǎng)物質(zhì)相對酵母膏釋放速度較慢，所以前期菌絲不會出現(xiàn)瘋長的情況，主要形成較為均勻的菌球，整個過程中菌球也較小而均勻，陳凝等[14]通過研究菌形對阿維菌素合成的影響時發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵中后期保持一定的菌球尺寸確實(shí)有利于產(chǎn)物阿維菌素的合成，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由于酵母粉相對遲效，在發(fā)酵后期依舊能夠給菌體提供足夠的氮源用于提供前體氨基酸以及維持菌體的自身代謝，保持一定的菌球尺寸以及相對穩(wěn)定的PMV。

莊英萍等[16]在進(jìn)行紅霉素的發(fā)酵調(diào)控中發(fā)現(xiàn)，氮源中的部分碳骨架可以用于合成菌體結(jié)構(gòu)，并且這對次級代謝產(chǎn)生目的產(chǎn)物有一定的影響，菌體前期以部分黃豆餅粉作為碳源合成菌體的實(shí)驗(yàn)組比前期單純使用葡萄糖合成菌體的對照組的最終放罐效價要高60%。通過分析以上不同氮源以及測定的各離線參數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)不同種類的氮源對阿維菌素的合成有著重要的影響，尤其是在發(fā)酵中后期保證足夠的氮源維持細(xì)胞代謝活性以及提供足夠的前體氨基酸[1]可以促進(jìn)產(chǎn)物的合成。

2.2 基于CER補(bǔ)加酵母粉的補(bǔ)料策略

在2.1的搖瓶實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)探究了不同氮源對阿維菌素合成的影響，與其他氮源相比，酵母作為氮源的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)物Bla濃度最高。推測其原因是使用速效氮源的實(shí)驗(yàn)組到了發(fā)酵后期由于受到氮源限制，造成菌體活性降低，菌球裂解，菌球外層菌絲脫落，菌球尺寸大幅度降低，菌濃降低，從而嚴(yán)重影響到產(chǎn)物合成能力?；诖?，在發(fā)酵中后期基于殘?zhí)茄a(bǔ)加碳源的原始工藝的基礎(chǔ)上基于CER額外補(bǔ)充酵母粉以維持發(fā)酵中后期的PMV、菌絲活性以及較高的產(chǎn)物合成速率。酵母粉中除了含有大量的氮源之外還有細(xì)胞生長所必需的微量元素以及生長因子，因此在發(fā)酵中后期補(bǔ)加酵母粉能夠維持菌濃，保證菌的活性以及為產(chǎn)物合成提供必需的氮源。

對照組按照原工藝從130 h之后根據(jù)殘?zhí)菨舛妊a(bǔ)加淀粉液化液，在發(fā)酵中后期將殘?zhí)强刂圃? g/L以上。實(shí)驗(yàn)組在對照組的基礎(chǔ)上額外補(bǔ)入酵母粉將CER維持在相對穩(wěn)定的水平。從圖2中可以明顯看到實(shí)驗(yàn)組與對照組在補(bǔ)料之前效價基本同步增長，其他各項(xiàng)參數(shù)包括最大菌濃、溶磷以及CER基本同步變化。130 h補(bǔ)料之后效價開始出現(xiàn)分叉點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組保持較快的產(chǎn)物合成速度，耗糖速率開始加快，CER回升并且在整個發(fā)酵過程中能夠維持在4 mmol/(L·h) 左右，這說明額外的氮源補(bǔ)入可以維持細(xì)胞代謝活性，從過程菌濃來看，兩組實(shí)驗(yàn)在200 h以前菌濃變化基本一致，150–200 h之間CER卻存在一定差異，說明在菌體量基本一致的情況下，額外補(bǔ)入酵母粉的實(shí)驗(yàn)組菌的代謝活力要明顯優(yōu)于只補(bǔ)碳源的對照組，相對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)物合成速率也要高于對照組。到330 h發(fā)酵結(jié)束，實(shí)驗(yàn)組的效價達(dá)到8 697 mg/L，對照組效價為6 852 mg/L，實(shí)驗(yàn)組效價較對照組高出26.9%。

另外，值得注意的是，實(shí)驗(yàn)組在200 h以及275 h出現(xiàn)了兩次明顯的效價不長的現(xiàn)象，從各代謝參數(shù)中可以發(fā)現(xiàn)伴隨著這一現(xiàn)象的同時發(fā)酵液中溶磷也有所升高。懷疑造成效價增長停止的現(xiàn)象的最主要因素就是補(bǔ)料過程中帶入了過量的無機(jī)磷鹽。無機(jī)磷鹽在代謝水平上對鏈霉菌有著嚴(yán)格的調(diào)控[17]。從大量的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中溶解磷含量高于10 mg/L時，會直接造成產(chǎn)物停止合成，所以在阿維菌素發(fā)酵中后期補(bǔ)料的原材料時，應(yīng)該嚴(yán)格控制其中無機(jī)磷的含量。

圖2 不同補(bǔ)料方式下阿維菌素合成過程中B1a與PMV (A)、B1a與總糖 (B)、B1a與溶磷(C) 以及CER (D)的變化

3 討論

本研究對比了4種常見氮源對阿維菌素合成的影響，發(fā)現(xiàn)不同氮源對阿維鏈霉菌的菌絲生長、菌形以及產(chǎn)物合成有較大的影響，其中酵母膏在前期促進(jìn)菌絲的快速生長，菌濃甚至可以達(dá)到50%以上，發(fā)酵液黏度過大導(dǎo)致傳氧和傳質(zhì)受到影響，造成菌絲形態(tài)向發(fā)散狀態(tài)發(fā)展；有大量的實(shí)驗(yàn)表明最有利于阿維菌素合成的是大小均勻、中間菌核較為緊密的菌球，發(fā)酵中后期由于受到底物限制，菌絲活性下降，菌球裂解造成菌濃的快速下降，導(dǎo)致發(fā)酵中后期產(chǎn)物合成速度下降。當(dāng)初始培養(yǎng)基中硫酸銨含量超過0.5%的時候就會在產(chǎn)素期間表現(xiàn)出強(qiáng)烈的產(chǎn)物抑制作用，所以在阿維菌素的發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制無機(jī)銨鹽的含量。當(dāng)以酵母粉作為氮源的時候，由于酵母粉中的氮源相比酵母膏來說要相對緩釋，既避免了前期菌絲的瘋長，也為發(fā)酵中后期提供足夠的氮源維持細(xì)胞活性以及產(chǎn)物合成所必需的氨基酸等前體物質(zhì)。以酵母粉作為氮源的實(shí)驗(yàn)組中菌球大小均勻合適，并且在整個發(fā)酵過程中能夠維持一定的菌球尺寸，有利于產(chǎn)物的合成。以上實(shí)驗(yàn)表明，氮源物質(zhì)在前期菌絲生長以及后期產(chǎn)物合成期間對于維持菌體活性以及菌體形態(tài)都有很重要的影響，后期為菌體提供足夠的氮源物質(zhì)能有效提高菌體活性、維持菌體形態(tài)以及提高產(chǎn)物的合成。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論，在100 L小試規(guī)模上根據(jù)在線參數(shù)CER補(bǔ)加酵母粉，將發(fā)酵過程中后期CER控制在4 mmol/(L·h) 的水平，補(bǔ)加酵母粉之后能夠促進(jìn)糖的吸收利用，維持菌體活性，維持菌體濃度以及一定的菌球尺寸并且可以大幅度提高B1a效價，最終實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)物B1a濃度達(dá)到 8 697 mg/L，較對照組提高26.9%。

He等[18]發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌中普遍存在的氮源調(diào)控因子GlnR不但是氮源全局調(diào)控因子，還可以通過鏈霉菌中的特異性途徑直接調(diào)節(jié)阿維菌素的合成，GlnR蛋白可以特異性激活阿維菌素合成過程中的一個正調(diào)控因子AveR的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)阿維菌素的合成。GlnR響應(yīng)環(huán)境中氮源變化，表達(dá)量增大，隨著GlnR蛋白表達(dá)量的增大可以特異性激活從而促進(jìn)阿維菌素的合成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中氮源對于產(chǎn)物合成的促進(jìn)作用是否是由于受到基因的調(diào)控還需要進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。

本文在基于殘?zhí)茄a(bǔ)加氮源的基礎(chǔ)上，基于過程CER補(bǔ)加酵母粉成功將B1a效價從6 852 mg/L提高至8 697 mg/L，提高了26.9%，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果有望在實(shí)際生產(chǎn)中有較好的應(yīng)用。

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Effect of nitrogen on avermectins biosynthesis and its fermentation optimization based on carbon-dioxide evolution rate

Yao Xu1, Tao Wu1, Meijin Guo1, Yingping Zhuang1, Deming Wang2, and Le Fan2

1,,200237,2(),,010000,,

China is now the largest and only producer of avermectin in the world. However, its current yield is still lower than other similar antibiotics. Therefore, we studied the effect of nitrogen on the growth and the synthesis ability of B1a to improve the overall yield. Nitrogen had significant effects on the cell activity, PMV ofand the synthesis of B1a in the middle and later phase of fermentation. Additional feeding yeast powder based on carbon-dioxide evolution rate in a 100-L bioreactor significantly improved the synthesis of B1a. The production of avermectin reached 8 697 mg/L, 26.9% higher than the original process. In short, this study will serve in production enhancement of avermectin at industrial production.

, avermectin, yeast powder, carbon-dioxide evolution rate (CER)

徐瑤, 吳濤, 郭美錦, 等. 氮源對阿維菌素合成的影響及基于二氧化碳釋放速率的阿維菌素發(fā)酵調(diào)控. 生物工程學(xué)報, 2020, 36(2): 287–294.

Xu Y, Wu T, Guo MJ, et al. Effect of nitrogen on avermectins biosynthesis and its fermentation optimization based on carbon-dioxide evolution rate. Chin J Biotech, 2019, 36(2): 287–294.

May19, 2019;

Accepted:September29, 2019

Yingping Zhuang. Tel: +86-21-64251257; E-mail: ypzhuang@ecust.edu.cn

10.13345/j.cjb.190204

2019-10-25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191024.1602.003.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)