洪偉，萬雯，崔古貞，官志忠，齊曉嵐，禹文峰

·綜 述·

艱難梭菌基因編輯技術(shù)研究進展

洪偉1,2，萬雯3，崔古貞4，官志忠1,2，齊曉嵐1,2，禹文峰1,2

1貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004 2貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004 3貴州醫(yī)科大學 病理學教研室，貴州 貴陽 550004 4貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物教研室，貴州 貴陽 550004

艱難梭菌是一種革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢、專性厭氧細菌，是醫(yī)院相關(guān)性腹瀉的主要病原體。近年來，隨著強毒株的出現(xiàn) (如核糖體027型)，其流行性與致死率逐年上升，因此對艱難梭菌生理、生化特征及致病機制的研究受到廣泛重視。艱難梭菌生理、生化特征及致病機制研究又以建立其穩(wěn)定、高效的基因編輯方法為必要前提。借助基因編輯工具，研究者可以擾動艱難梭菌核心生物學過程，在分子水平研究其分子致病機制如ClosTron技術(shù)在艱難梭菌毒素A (Toxin A) 和毒素B (Toxin B) 與其致病力關(guān)系的研究中起到了關(guān)鍵作用。文中以時間為主線綜述了艱難梭菌基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程和最新進展，并對艱難梭菌基因編輯技術(shù)未來的研究方向進行展望。

艱難梭菌，艱難梭菌感染，基因編輯，基因功能研究，致病機制

1953年Hall與O’Toole首次從新生兒糞便樣本中分離到艱難梭菌[1]。艱難梭菌是一種革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢、專性厭氧棒狀桿菌。20世紀70年代末，研究者確認艱難梭菌導致20%–25%的抗生素相關(guān)性腹瀉[2]。艱難梭菌感染(infection，CDI) 的主要癥狀有腹瀉、腹痛、發(fā)燒、中毒性巨結(jié)腸、腸道穿孔等[3]。從2000年開始，北美、歐洲、亞洲CDI發(fā)病率和致死率明顯增加[4]。如2002年艱難梭菌強毒株的出現(xiàn)(核糖體BI/NAP1/027型，同時產(chǎn)生毒素A、毒素B和二元毒素)，導致CDI在歐洲大面積暴發(fā)，其致病率與致死率顯著提高[3,5]。如今，在北美和歐洲，每10 000例住院病人中，就有7例CDI患者。CDI已成為醫(yī)院獲得性感染中的首要疾病[6-7]。在全球CDI防控形勢嚴峻的前提下，2013年美國疾病預防與控制中心將艱難梭菌與抗碳青霉烯的腸桿菌及耐藥性淋病奈瑟菌并列為3種最緊急的多重耐藥病原微生物[8-9]。

隨著CDI致病率的逐年提高，研究人員想要通過建立艱難梭菌基因編輯系統(tǒng)，以研究其生理、生化特征和致病機制。2003年，Roberts等在艱難梭菌中建立的基于Tn916的反義RNA干擾技術(shù)，揭示了細胞壁結(jié)合蛋白66 (Cell wall protein 66，Cwp66)對艱難梭菌的細胞黏附能力的貢獻[10]。2007年，Heap等基于乳酸球菌()基因(Ll.ltrB) 二型內(nèi)含子建立了ClosTron基因失活方法。應用該方法Heap等揭示了(The master regulator of sporulation)、(Spore cortex-lytic enzymes)基因在艱難梭菌芽孢產(chǎn)生中的調(diào)控作用[11-13]，驗證了毒素A與毒素B都具有細胞毒性和致病能力[14]，修正了毒素A不能單獨引起腸炎的結(jié)論[15]。2010年，基于隨機突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了基因?qū)τ谄D難梭菌芽孢產(chǎn)生具有貢獻[16]。2012年，基于尿嘧啶合成缺陷突變株(Δ) 的基因敲除方法的建立，修正了負調(diào)控毒素基因表達的假說[17]。2013年，基于Δ基因的非等長同源臂偶聯(lián)等位交換(Allele-coupled exchange，ACE) 技術(shù)的建立，使得基因的功能得以揭示[18-19]。除此之外，基因與毒素基因表達調(diào)控關(guān)系的闡明[20]、鞭毛蛋白編碼基因在艱難梭菌中的多基因調(diào)控功能的闡明[21]，以及艱難梭菌疫苗的研發(fā)[22]，都是以基因編輯技術(shù)的建立為前提。由此可見，艱難梭菌基因編輯技術(shù)的建立對于研究其生理、生化特征和致病機制至關(guān)重要。

艱難梭菌基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了反義RNA干擾技術(shù)、ClosTron技術(shù)、轉(zhuǎn)座子隨機基因失活技術(shù)、ACE技術(shù)和CRISPR-Cas技術(shù)等不同發(fā)展階段(圖1)。文中以時間為主線，綜述艱難梭菌基因編輯技術(shù)研究進展并展望未來的發(fā)展方向。

圖1 艱難梭菌基因編輯技術(shù)的不同發(fā)展階段[10-11, 16, 19, 23-30]

1 艱難梭菌基因編輯的前提條件(2002– 2004年)

實現(xiàn)艱難梭菌基因編輯需3個前提條件： 1) 基因組序列測定完成[31]；2) 建立可在大腸桿菌-艱難梭菌中穿梭復制的質(zhì)粒系統(tǒng)；3) 突破限制性內(nèi)切酶屏障，建立外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法，詳述如下。

1.1 基因組序列信息

基因組序列信息包含：基因序列、基因注釋和基因排列方式等信息，是基因編輯技術(shù)建立的重要前提。2006年，Mohammed等發(fā)表了艱難梭菌630菌株(630，630)的全基因組序列[31]，該研究發(fā)現(xiàn)630基因組中包含大量可移動的基因元件(11%)，這些可移動基因元件可能與抗生素抗性、菌株毒力、與宿主相互作用等機制具有密切關(guān)系。2015年，Eijk等測定了630Δ(紅霉素敏感) 菌株的全基因組序列，該菌株基因組與630菌株共有71個位點不同，包括8個刪除突變、10個插入突變和50個堿基替換突變等不同突變形式[32]。630與630Δ菌株基因組序列的公布，為后續(xù)基因編輯技術(shù)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1.2 建立可在大腸桿菌-艱難梭菌中穿梭復制的質(zhì)粒系統(tǒng)

2002年，Purdy等發(fā)現(xiàn)了630內(nèi)源質(zhì)粒pCD6，該質(zhì)粒大小為6 829 bp，GC含量為24.5%，包含5個開放閱讀框(Open reading frame，)：、、、和(圖2)[23, 33]。大小為3 994 bp，編碼復制蛋白，其下游有一段重復序列，可驅(qū)動質(zhì)粒在630中復制。編碼未知功能肽段且不是復制必需的。和也位于復制區(qū)域，但是功能未知。編碼長度為187個氨基酸的蛋白質(zhì)，與胞壁酰五肽羧肽酶有相似性，推測參與細胞壁的生物合成。Purdy等使用pCD6復制子 () 構(gòu)建了pMTL9301質(zhì)粒，該質(zhì)粒在艱難梭菌中的轉(zhuǎn)化效率較高(5.7×10–5轉(zhuǎn)化子/質(zhì)粒供體)。連續(xù)傳代實驗表明，pMTL9301在艱難梭菌中可以穩(wěn)定復制。在無抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)32次傳代后，僅有8%的克隆丟失質(zhì)粒。相比之下，pMTL9401 (pB102復制子) 在同樣的培養(yǎng)條件下，有96%的菌體丟失了質(zhì)粒[23]。因此pCD6復制子被用于構(gòu)建大腸桿菌-艱難梭菌穿梭質(zhì)粒[34]。該質(zhì)粒可在大腸桿菌(CA434) 協(xié)助質(zhì)粒 (Helper plasmid) 的幫助下，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方式進入艱難梭菌中，并可在其中穩(wěn)定復制[23]。

圖2 pCD6質(zhì)粒圖譜

1.3 突破限制性內(nèi)切酶屏障，建立外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法

限制性酶修飾系統(tǒng)(Restriction/modification system，RM系統(tǒng))是一種微生物應對外源DNA入侵的防御機制[35]。RM系統(tǒng)由限制性內(nèi)切酶和DNA甲基化酶組成。DNA甲基化酶通過對自身DNA的甲基化，保護其免受自身限制性內(nèi)切酶切割，否則則被限制性內(nèi)切酶降解。實現(xiàn)外源DNA轉(zhuǎn)化艱難梭菌的前提條件是突破其固有的RM系統(tǒng)，可以通過兩種方式實現(xiàn)：1) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化之前，在體外修飾或刪除質(zhì)粒中的限制性內(nèi)切酶切割位點，從而保護外源質(zhì)粒不受內(nèi)源性的限制性內(nèi)切酶切割[23]；如pMTL9301質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化3和6菌株之前，質(zhì)粒上的Ⅰ位點被同義突變，從而避免了3和6菌株的RM系統(tǒng)對質(zhì)粒的切割[23]；2) 失活宿主菌株內(nèi)部的RM系統(tǒng)。如在解纖維梭菌中敲除2866基因(該基因編碼Ⅰ限制性內(nèi)切酶)[36]；在丙酮丁醇梭菌ATCC 824和DSM 1731菌株中失活基因后(編碼Ⅱ型限制性內(nèi)切酶)，外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率顯著提高[37, 38]。在巴氏梭菌24 ()菌株中采用類似的方法，也獲得了較高的外源DNA轉(zhuǎn)化效率[39]。

不同艱難梭菌的限制性酶修飾系統(tǒng)具有明顯的差異，如在6菌株中存在兩種RM系統(tǒng)：96Ⅰ/M.96Ⅰ(5′-GGNMCC-3′) 與Ⅰ/M.Ⅰ(5′-GMATC-3′)，而3只有Ⅱ型限制性內(nèi)切酶Ⅰ，該酶識別并切割5′-CATCG-3′序列。另外，630菌株中并未發(fā)現(xiàn)RM屏障[23]。隨著基因組測序和分析技術(shù)的進步，出現(xiàn)了計算機程序輔助的RM系統(tǒng)預測方法，如REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/) 網(wǎng)站預測了常見微生物的RM系統(tǒng)編碼信息。研究者可以通過該網(wǎng)站查詢某菌株RM系統(tǒng)信息，從而有針對性地失活其RM系統(tǒng)。綜上所述，在測定了艱難梭菌全基因組序列、獲得了艱難梭菌復制元件和揭示了艱難梭菌不同菌株的RM系統(tǒng)后，基本具備了建立艱難梭菌基因編輯方法的3個前提。

2 基于Tn916的反義RNA技術(shù)(2003年)

2003年Roberts等利用來源于枯草芽孢桿菌的Tn916轉(zhuǎn)座子，攜帶一段反義RNA編碼序列下調(diào)基因的表達。Cwp66蛋白含有兩個結(jié)構(gòu)域：N端與枯草芽孢桿菌CwlB (Peptidoglycan recognition domain) 具有同源性；C端結(jié)構(gòu)域定位在細胞膜的表面[40]，因此推測其與艱難梭菌細胞黏附功能有關(guān)。Tn916是一種廣宿主結(jié)合轉(zhuǎn)移元件，并為宿主提供四環(huán)素抗性(TcR) 決定基因[41]。該轉(zhuǎn)座子可在破傷風梭菌[42]和丙酮丁醇梭菌[36]基因組中跳躍，且跳躍位點具有明顯的偏好性[43]。利用該特性，Roberts等首先克隆并改造了Tn916轉(zhuǎn)座子，在其中加入了基因反義RNA表達框。將該改造后的轉(zhuǎn)座子作為供體結(jié)合轉(zhuǎn)移至630菌株，從而嘗試降低基因的表達量(圖3)[10]。然而，該研究并沒有顯著降低Cwp66蛋白的表達和改變艱難梭菌對細胞的粘附能力，作者推測可能的原因是：1) Cwp66蛋白本身可能并不參與艱難梭菌與細胞的黏附過程；2) 基于Tn916的反義RNA并未發(fā)揮作用。除此之外，基于Tn916轉(zhuǎn)座子的反義RNA技術(shù)還具有如下局限性：1) Tn916在基因組中 的插入位點具有較強的偏好性，使得該技術(shù)并 不適合用于隨機突變和理性靶向突變；2) 該技術(shù)產(chǎn)生的反義RNA的量對靶基因表達的調(diào)節(jié)能力有限。

3 ClosTron技術(shù)(2007年)

2007年，梭菌基因編輯的先驅(qū)Minton研究組，Heap等將來源于乳酸球菌基因的Ll.ltrB二型內(nèi)含子與穿梭質(zhì)粒融合，開發(fā)了首個能夠在梭菌中通用的基因失活工具——ClosTron，該系統(tǒng)借助二型內(nèi)含子可重編碼的“歸巢(Retrohoming)”效應[44-45]，成功地在艱難梭菌、丙酮丁醇梭菌和生孢梭菌等菌株中實現(xiàn)了靶向基因失活(圖4)[12,24-27]。該研究組在接下來的工作中進一步改進了ClosTron系統(tǒng)，如在ClosTron質(zhì)粒上加入了轉(zhuǎn)座激活篩選基因(Retrotransposition- activated marker，RAM)，從而提高了突變株的篩選效率[46]；建立了免費的引物設計網(wǎng)站http://clostron.com，提高打靶效率；在質(zhì)粒載體構(gòu)建過程中加入藍白斑篩選標記，從而提高載體構(gòu)建和篩選的效率[25]。

圖3 基于Tn916的反義RNA敲降cwp66基因表達[10]

ClosTron技術(shù)可在10–14 d內(nèi)快速獲得靶基因失活突變株，因此極大地提高了梭菌屬細菌突變株構(gòu)建效率。該技術(shù)目前仍是艱難梭菌突變株構(gòu)建的主要工具，并被深度開發(fā)為艱難梭菌必需基因檢測手段[47]。2010年Minton研究組發(fā)表了使用ClosTron技術(shù)對艱難梭菌毒素基因的研究結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)Toxin A和Toxin B都具有細胞毒性，并都能夠單獨在倉鼠模型中誘導腸道疾病的發(fā)生[15]。

ClosTron系統(tǒng)的核心元件二型內(nèi)含子(GroupⅡintron) 是具有催化活性的核酶，其剪接機制與Ⅰ型內(nèi)含子的剪接相似，也需要形成一個套索的中間體，通過5′-2′磷酸二酯鍵將剪接的位點連接到一起。與Ⅰ型內(nèi)含子不同的是Ⅱ型內(nèi)含子具有自我剪接的功能(核酶活性)，不需要剪接體和核小RNA (snRNA) 的參與，也不需要ATP供能[48]。

ClosTron系統(tǒng)借助Ⅱ型內(nèi)含子“歸巢”效應，即具有核酶活性Ⅱ型內(nèi)含子RNA在IEP (Intron encoded protein) 的協(xié)助下，插入DNA鏈靶位點的過程，實現(xiàn)任意靶基因的插入失活。來源于乳酸球菌的Ll.ltrBⅡ型內(nèi)含“歸巢”過程分為兩個階段(圖4)。第一階段，Ⅱ型內(nèi)含子RNA前體“自我拼接”形成套索RNA和重組的外顯子(圖4A)[49]；第二階段，套索RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)輔助下“歸巢”至靶DNA位點[50](圖4)。

圖4 ClosTron系統(tǒng)的自我剪接及“歸巢”[48-49]

綜上所述，Ⅱ型內(nèi)含子由具有核酶催化活性的Ⅱ型內(nèi)含子RNA和IEP組成。Ⅱ型內(nèi)含子RNA“自我拼接”成套索RNA，套索RNA與IEP形成核糖核蛋白復合體(RNPs)，RNPs通過“歸巢”效應特異性地插入、失活靶基因，該過程可以通過重新編碼內(nèi)含子識別位點，實現(xiàn)打靶位點的“重編程”[51]。

4 基于Himar1C9的艱難梭菌隨機失活工具(2010年)

如前文所述，Tn916轉(zhuǎn)座子被用于艱難梭菌基因編輯[10]，然而，Tn916轉(zhuǎn)座子識別位點特異性高，突變體庫豐度低，不適合改造成基因組隨機失活工具[16]。來源于角蠅的Himar1C9轉(zhuǎn)座子，屬于mariner/Tc1轉(zhuǎn)座子家族[52-53]，靶向TA二核苷酸識別位點[54]，可以在多種微生物基因組中活躍跳躍[55-56]。其轉(zhuǎn)座過程如圖5所示，DNA雙鏈被轉(zhuǎn)座子切割出2 nt粘性末端，產(chǎn)生3′-羥基。切割產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座子可在染色體中跳躍，插入基因組中其他TA位點[54]。Mimar19轉(zhuǎn)座子靶序列識別范圍廣，且相對嚴謹，因此構(gòu)建突變株單插入率高達98.3%；不僅如此，Himar1可自我催化完成轉(zhuǎn)座全過程，無需其他蛋白輔助，便于打靶載體構(gòu)建。因此，Cartman等將Himar1C9改造成了艱難梭菌隨機突變工具，并應用該工具建立了艱難梭菌R20291突變體庫。對該突變體庫的篩選，獲得了芽孢復蘇蛋白酶基因突變株和嘧啶生物合成營養(yǎng)缺陷型基因突變株。

5 基于codA基因的精確基因失活系統(tǒng)(2012年)

Cartman等將來源于大腸桿菌的胞嘧啶脫氨基酶基因(Cytosine deaminase gene，) 作為負篩選標記，在艱難梭菌中建立了無痕基因編輯系統(tǒng)。CodA蛋白催化胞嘧啶脫氨基形成尿嘧啶。該酶底物特異性不高，也可以催化無毒嘧啶類似物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC) 為具有較強細胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)。5-FU在尿嘧啶磷酸生物合成轉(zhuǎn)移酶(Uracil phosphoribosyltransferase，EC 2.4.2.9) 的催化下，經(jīng)過下游反應不可逆地抑制胸腺嘧啶合成酶的活性(核苷酸生物合成的關(guān)鍵酶)，并錯誤地將5-FU引入DNA和RNA中，導致宿主死亡。利用CodA可將無毒5-FC轉(zhuǎn)化為較強細胞毒性的5-FU的特性，將基因與尿素磷酸轉(zhuǎn)移酶(UPP) 基因共表達，作為反向篩選標記，可實現(xiàn)艱難梭菌無痕的靶向基因敲除(圖6)。有趣的是，單交換的艱難梭菌在BHIS平板上形成的菌落因比未發(fā)生單交換菌株形成的菌落大，可以直觀地通過菌落的大小判斷是否發(fā)生單交換，因此該質(zhì)粒骨架也被形象地稱為“假自殺”質(zhì)粒[18]。

圖5 mariner/Tc1轉(zhuǎn)座子家族轉(zhuǎn)座模型[16]

圖6 基于codA基因的無痕基因失活過程[18]

6 基于非等長同源臂偶聯(lián)等位交換的艱難梭菌精確、無痕基因編輯技術(shù)(2013年)

2012年Heap等發(fā)表了非等長同源臂偶聯(lián)等位交換(Allele-coupled exchange，ACE) 基因編輯方法[57]。該方法基于Δ突變株(乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶突變株，orotate phosphoribosyltransferasemutant)和非等長同源臂偶聯(lián)等位交換，可通過不同長度同源臂精確控制單、雙交換發(fā)生的次序，從而實現(xiàn)高效、無痕基因敲除?；蚴青奏念^生物合成的必需基因?；诨蚩蓪崿F(xiàn)雙向篩選：1) 該基因缺失，會造成突變株無法從頭合成尿嘧啶，導致細菌死亡；2) 該基因存在，可將5-FU摻入DNA和RNA分子中，導致細菌死亡。換言之，基因缺失突變株不能在尿嘧啶限制性培養(yǎng)基中生長，而含有基因的菌株不能在含有5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid，5-FOA，可轉(zhuǎn)化為5-FU)的培養(yǎng)基中生長。因此，基因可作為正向(含有生存) 和負向(含有基因死亡) 篩選標記[57]。ACE方法對于不能直接轉(zhuǎn)化自殺質(zhì)粒、難于遺傳改造的菌株(如艱難梭菌、熱纖梭菌等)具有重要意義，可以極大地加速突變的篩選速度，且不會像ClosTron技術(shù)一樣在基因組中引入外源DNA片段，因此可減少極性效應的產(chǎn)生和提高基因突變株染色體的穩(wěn)定性。

使用ACE方法構(gòu)建基因突變株的過程如圖7A所示，敲除載體包含、、、RepH復制蛋白，以及基因上游同源臂(LHA，約300 bp)、α片段和下游同源臂(RHA，約1 200 bp)。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化艱難梭菌后，在氯霉素培養(yǎng)基中篩選發(fā)生單交換的菌株(圖7A)。單交換菌株擴增后再涂布在5-FOA平板上，發(fā)生單交換菌株因含有基因被淘汰(負篩選)。發(fā)生雙交換的菌株因基因缺失而對5-FOA具有抗性，即獲得Δ突變株。Δ突變株因?qū)?-FOA具有抗性且在尿嘧啶限制性培養(yǎng)基中不能生長，用作后續(xù)基因敲除的底盤細胞。

以Δ突變株作為底盤細胞，突變株構(gòu)建過程如圖7B所示。敲除載體包含300 bp上游同源臂、攜帶突變的基因和1 200 bp下游同源臂，另外還包含來源于產(chǎn)孢梭菌的基因(與630菌株基因僅有65%同源性，可降低同源重組概率，圖7B)。該載體轉(zhuǎn)化進入630后，首先在氯霉素培養(yǎng)基中篩選單交換菌株。由于未發(fā)生單交換的質(zhì)粒會造成營養(yǎng)負擔，因此在氯霉素平板上形成小菌落。相反，發(fā)生單交換的菌落，因為抗生素基因已經(jīng)整合進入基因組，營養(yǎng)負擔小，形成較大菌落。挑取發(fā)生單交換的大菌落涂布于含有5-FOA的平板上，單交換菌株因攜帶外源基因，所以對5-FOA敏感，因此發(fā)生雙交換的ΔΔ菌株能夠生存下來。

在獲得目標基因的突變株后，基因被自身的啟動子或強啟動子回補至艱難梭菌基因組中，以確保突變株的鑒定在尿嘧啶合成充分的情況下進行(圖7)。利用ACE技術(shù)，作者在艱難梭菌菌株中成功敲除了、(Cysteine protease)、(Mannitol-1-phosphate) 基因[19]。Δ產(chǎn)芽孢能力比野生型菌株低104倍，Δ菌株對S-layer protein A (SlpA) 蛋白切割效率急劇降低，Δ喪失了甘露醇利用能力[19]。

7 CRISPR-Cas9系統(tǒng)(2017–2018年)

串聯(lián)規(guī)律間隔短回文序列(Cluster regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) 和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein，Cas) 組成的CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA和Cas蛋白介導的細菌和古菌免疫系統(tǒng)[58]。最近幾年，來源于化膿性鏈球菌的CRISRPR-Cas9元件被廣泛應用于原核生物和真核生物的精確基因編輯[58-72]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)有2個主要的組分：1) Cas9效應蛋白；2) 用于指導Cas9蛋白識別靶位點的crRNA (CRISPRRNA)和tracrRNA (-activating crRNA)。Cas9效應蛋白與crRNA、tracrRNA組成蛋白質(zhì)核酸復合體(RNP) 能夠特異性的識別PAM序列(Protospacer adjacent motif，PAM，5′-NGG-3′) 前的20 nt核苷酸，并在Cas9核酸內(nèi)切酶的作用下產(chǎn)生雙鏈DNA平末端缺口(Double-strand break，DSB)。為了簡化CRISPR-Cas9系統(tǒng)，Mali等將crRNA和tracrRNA整合在一起，形成單一嵌合型導向RNA (Single chimeric guide RNA，sgRNA)，sgRNA同樣具有指導Cas9蛋白識別靶位點的功能[73]。在真核生物中，DSB缺口可以通過非同源性末端連接系統(tǒng)修復(Nonhomologous end-joining repair pathway，NHEJ)，并在修復過程中會產(chǎn)生插入/刪除突變，從而導致基因編碼的蛋白質(zhì)讀碼框發(fā)生移碼突變，造成靶基因的失活。然而，在大多原核生物中，由于缺乏NHEJ酶系，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因組雙鏈中產(chǎn)生DSB后，微生物細胞不能自主修復，產(chǎn)生DNA復制缺陷，導致宿主細菌死亡。當基因打靶質(zhì)粒提供DSB切割位點兩側(cè)同源臂時，斷裂基因組發(fā)生依賴同源重組的基因修復，(Homology-directed repair，HDR)，其結(jié)果為：1) 細菌得以存活；2) 依賴同源臂，引入DNA突變(插入、缺失、刪除等)[74]。

圖7 基于ACE的艱難梭菌精確、無痕基因編輯技術(shù)[19]

艱難梭菌中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)由McAllister等于2017年建立。該系統(tǒng)使用脫水四環(huán)素誘導啟動子() 驅(qū)動密碼子優(yōu)化的Cas9基因的表達，使用改造后的谷氨酸脫氫酶()啟動子啟動sgRNA表達，靶基因() 同源臂被放在結(jié)合轉(zhuǎn)移元件和啟動子之間(圖8)。該系統(tǒng)對基因(Selenophosphate synthetase) 的敲除效率為20%–50%，Δ突變株生長速度極度降低，缺失了將硒元素螯合進入硒蛋白的能力[28]。CRISPR-Cas9技術(shù)的應用，克服了ClosTron基因失活時插入二型內(nèi)含子而產(chǎn)生的極性效應(基因插入引起的上、下游基因表達變化) 和ACE方法需要先構(gòu)建ΔΔ底盤細胞，敲除靶基因后再回補基因的繁瑣過程，是目前艱難梭菌基因編輯工具中最簡單、高效的方法。

圖8 CRISPR-Cas9技術(shù)敲除艱難梭菌Spo0A基因和敲入PpFbFpm基因[29]

2018年，本課題組(王邵花、洪偉等) 獨立構(gòu)建了一套CRISPR-Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)以乳糖誘導啟動子啟動Cas9蛋白的表達，以小RNA啟動子(sRNAP) 啟動sgRNA的表達。使用該質(zhì)粒系統(tǒng)實現(xiàn)了630菌株的A基因的敲除(圖8A) 和厭氧綠色熒光蛋白基因的敲入(圖8B)，效率分別為：80%和100%[29]。表型分析結(jié)果表明，Δ突變株產(chǎn)生芽孢的能力急劇下降，基因插入突變株在熒光顯微鏡下可見明顯的綠色熒光信號[29]。

8 CRISPR-Cpf1系統(tǒng)(2018年)

與CRISPR-Cas9系統(tǒng)相似，CRISPR-Cpf1系統(tǒng)也是基于核酸內(nèi)切酶的細菌免疫系統(tǒng)。CRISPR-Cpf1系統(tǒng)來源于U112菌株[70]，與Cas9相比CRISPR-Cpf1具有以下獨特的特點：1) Cpf1核酸酶僅由單一crRNA導向，不需要tracrRNA參與；2) Cpf1核酸內(nèi)切酶識別富含T的PAM序列(5′-TTTN-3′)，更適合低GC含量微生物基因編輯(如艱難梭菌)；3) Cpf1在遠離PAM序列端，將DNA雙鏈切割為粘性末端[65]。

我們研究組將CRISPR-Cpf1系統(tǒng)開發(fā)成了高效艱難梭菌基因編輯“工具箱”[30]。該“工具箱”中的核心“工具”為CRISPR-Cpf1打靶質(zhì)粒(圖9)，其組成如下：基因在乳糖誘導啟動子()的啟動下表達，基因下游緊跟一個終止子()；以小RNA啟動子(Small RNA promoter，sRNAP) 啟動基因的表達。根據(jù)CRISPR-Cpf1系統(tǒng)僅需crRNA無需tracrRNA的特點，我們提出了一步組裝法(One step assembly, OSA)。該方法將與靶基因上、下游同源臂同時組裝，從而將基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建周期縮短至原來的一半，僅用兩天時間就可以獲得基因打靶載體。除此之外，我們還為OSA方法開發(fā)了靶位點尋找和突變引物設計軟件(OSAprimer finder，OPF)，可以在1分鐘內(nèi)設計好構(gòu)建打靶載體所需的引物。OSA方法與OPF工具結(jié)合，極大地提高了艱難梭菌的基因編輯效率[30]。

圖9 使用CRISPR-Cpf1技術(shù)實現(xiàn)在艱難梭菌基因編輯[30]

我們使用以上建立的CRISPR-Cpf1“工具箱”，針對630菌株()、()、()、、()、() 基因進行了靶向基因敲除，基因敲除效率從25%–100%不等。并首次在630菌株中實現(xiàn)了使用同一載體同時編輯兩個基因(和)。另外，CRISPR-Cpf1技術(shù)還實現(xiàn)了長達49 kb的基因座敲除，這是目前艱難梭菌中最長的靶基因敲除成功案例。另外，基于該系統(tǒng)的打靶質(zhì)?？梢酝ㄟ^連續(xù)傳代的方式丟失，因此能夠?qū)崿F(xiàn)抗性基因的回收，從而實現(xiàn)使用同一篩選標記連續(xù)敲除不同基因(如和基因)。綜上所述，我們開發(fā)的CRISPR-Cpf1“工具箱”可以極大加速艱難梭菌基因編輯進程，為揭示艱難梭菌生理生化特征、致病機制和開發(fā)對抗CDI的新療法提供技術(shù)支持[30]。

9 基因編輯系統(tǒng)展望

本文綜述了艱難梭菌基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程和最新進展。2002–2004年之間，艱難梭菌限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)得以揭示、克隆了pCD6復制子、實現(xiàn)了外源質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移，這些方法的建立、元件的獲得，為艱難梭菌基因編輯技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。艱難梭菌基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了反義RNA、隨機轉(zhuǎn)座子、ClosTron技術(shù)、ACE技術(shù)、CRISPR-Cas技術(shù)等不同階段[10-11,16,19,25,29,30]。實現(xiàn)了從隨機基因失活到靶向基因失活、從低效率基因失活到高效基因失活的技術(shù)進步(表1)。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，艱難梭菌毒力基因在CDI發(fā)生過程中的作用[14]、孢子產(chǎn)生機制()[12]、腸壁黏附機制(，)[10,30,40,75]、抗生素抗性基因功能(，) 等得以闡明[30]。由此可見快速、高效、準確的基因編輯技術(shù)，在艱難梭菌致病機制、生理、生化特征的研究過程中起到了核心作用，在未來可能進一步影響CDI的防治措施和策略的制定，為更好地預防和控制CDI感染提供理論支持。

除了外源性CRISPR-Cas系統(tǒng)，艱難梭菌內(nèi)源性CRISPR-Cas也是研究的熱點。在217株艱難梭菌基因組中，內(nèi)源性IB型(type IB)CRISPR- Cas系統(tǒng)存在于保守的基因組位點[76]。深度轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)630菌株Ⅰ型CRISPR系統(tǒng)(typeⅠ) 具有高度的轉(zhuǎn)錄活性[77]。Boudry等的研究闡明了在630和R20291菌株中的ⅠB型CRISPR系統(tǒng)的作用機制，并在體外驗證了該系統(tǒng)的活性[78]。630和R20291分別編碼12個和13個可能的CRISPR陣列，其中5個定位于原噬菌體 (Prophage) 區(qū)域。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在實驗室條件下，630和R20291分別有12個和9個CRISPR陣列都處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。體外實驗表明該系統(tǒng)在大腸桿菌中具有雙鏈DNA靶向切割活性。由此可見，艱難梭菌內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)具有改造成為基因編輯工具的潛力?！敖壖堋逼D難梭菌內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)用于其基因編輯，無需外源表達Cas9/Cpf1效應蛋白，因此可極大地降低打靶載體的分子量，提高外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率，從而提高基因編輯的成功率。使用ⅠB型CRISPR系統(tǒng)完成基因編輯已有先例，如張杰等使用酪丁酸梭菌內(nèi)源性的CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建的基因編輯工具，編輯酪丁酸梭菌產(chǎn)溶劑代謝通路，獲得了目前為止最高的丙酮-丁醇-乙醇產(chǎn)量[79]。由此可見，在艱難梭菌中建立內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)也很有可能進一步提高艱難梭菌基因編輯效率。

表1 艱難梭菌中不同基因編輯方法比較

CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因組中產(chǎn)生的DSB有兩種修復方式，一種是HDR，一種是NHEJ。在大多數(shù)原核生物中，沒有NHEJ修復方式。Yang 等在恥垢分枝桿菌中測試了14種Cas效應蛋白，發(fā)現(xiàn)CRISPR-FnCpf1_cg系統(tǒng)能夠在該菌株中實現(xiàn)NHEJ型的基因編輯[80]。NHEJ型DSB修復具有修復速度快、載體構(gòu)建簡單等優(yōu)點(無需同源臂)。但是NHEJ的實現(xiàn)需要宿主中具備NHEJ支持酶系統(tǒng)。遺憾的是，艱難梭菌并不具備NHEJ酶系。在艱難梭菌中外源表達NHEJ支持酶系統(tǒng)以實現(xiàn)NHEJ型DBS修復，可能進一步提高其基因編輯的效率。

CRISPR-Cas系統(tǒng)在艱難梭菌中的成功建立，極大地加快了艱難梭菌基因編輯效率。該系統(tǒng)具有高效、無痕、操作簡單等諸多優(yōu)點，也賦予了基因編輯超高的靈活性。王義等使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在拜氏梭菌中實現(xiàn)了單堿基編輯[71]，在基因組編輯的精度上有了較大提升，對于精確改變核心基因的功能具有重要意義。目前，單堿基編輯在艱難梭菌中尚未見報道，可能是未來研究的重要方向。

目前艱難梭菌基因編輯方法的研究還有以下不足：1) 艱難梭菌轉(zhuǎn)化效率較低。實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化是基因編輯的最重要的前提條件，然而目前艱難梭菌僅適用于轉(zhuǎn)化效率較低的轉(zhuǎn)化方法。因此，進一步提高艱難梭菌外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率，可以提升其基因編輯效率，如開發(fā)高效的電轉(zhuǎn)化方法等。2) CRISPR-Cas系統(tǒng)在艱難梭菌中是否存在脫靶現(xiàn)象尚未闡明。有報道稱，Cas9蛋白在微生物中具有毒性[74]，毒性的產(chǎn)生可能與Cas9異常脫靶有關(guān)。在未來的研究中，利用生物信息學技術(shù)分析打靶嚴謹位點的特征，從而設計出更加精確的“基因剪刀”是CRISPR-Cas系統(tǒng)需要解決的技術(shù)難題之一。目前，針對艱難梭菌中的CRISPR-Cas9脫靶的問題還沒有深入研究。因此，借鑒其他物種中解決CRISPR系統(tǒng)脫靶問題的方法，進一步完善和改進該系統(tǒng)是未來重要的研究方向。3) 艱難梭菌高通量基因編輯方法尚待開發(fā)。目前在艱難梭菌中的基因編輯技術(shù)主要針對單基因和最多兩個基因的編輯[74]。有報道稱，使用轉(zhuǎn)座子攜帶的dCas9系統(tǒng)，可以實現(xiàn)同時在多個物種中、調(diào)控多個基因的表達[81]。這種高通量基因編輯方式，對于研究病原微生物對抗生素的耐藥性及治療“超級”細菌的感染患者提供了新的思路?？赡茉诓痪玫膶?，面對耐藥艱難梭菌，也許我們可以首先通過該方法，改變其對抗生素的敏感性，從而使用現(xiàn)有的抗生素有效地根除CDI。

綜上所述，艱難梭菌的基因編輯系統(tǒng)在過去的20年間取得了長足的進步。這些進步推動了艱難梭菌生理、生化特征、致病機制、治療及防控的研究。隨著以上機制的闡明，相信在不久的將來，臨床醫(yī)生可以更好地預防和治療CDI。

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Advances ingenome editing

Wei Hong1,2, Wen Wan3, Guzhen Cui4, Zhizhong Guan1,2, Xiaolan Qi1,2, and Wenfeng Yu1,2

1 Key Laboratory of Endemic and Ethnic Diseases,Ministry of Education, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China 2 Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Guizhou Province, Guiyang 550004, Guizhou, China 3 Department of Pathology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China 4 Department of Microbiology,School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China

is a Gram-positive, spore-forming, obligate anaerobic bacterium, and the main cause of hospital-associated diarrhea. In recent years, with the presence of virulent strains (i.e., ribosome type 027), the prevalence and mortality events have increased. Thus, studies on physiological and biochemical characteristics, and pathogenic mechanisms ofhave been performed. The development of efficient and stable genome-editing methods foris urgent for the dissection of its physiological and pathogenic mechanism. For example, ClosTron technology plays a key role in study of the relationship betweentoxins (Toxin A and Toxin B) and its pathogenicity. This article reviews the history, recent progress and future prospects ofgenome-editing technologies.

,infection (CDI), genome editing,gene function research, pathogenic mechanism

洪偉, 萬雯, 崔古貞, 等. 艱難梭菌基因編輯技術(shù)研究進展. 生物工程學報, 2020, 36(2): 210–225.

Hong W, Wan W, Cui GZ, et al. Advances ingenome editing. Chin J Biotech, 2020, 36(2): 210–225.

May 2, 2019;

July 10, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31560318, 31601012, 31760318, U1812403), Guizhou Science and Technology Project (Qiankehepintairencai No. [2017]5652).

Wei Hong. Tel: +86-851-86752814; E-mail: hongwei@gmc.edu.cn

10.13345/j.cjb.190171

國家自然科學基金 (Nos. 31560318，31601012，31760318，U1812403)，貴州省科技計劃項目黔科合平臺人才 (No. [2017]5652) 資助。

2019-10-30

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191030.0939.001.html

(本文責編 陳宏宇)