王冰璇，司文，吳燁飛，張心齊，汪石瑩，吳酬飛，林海萍，尹良鴻

·綜 述·

藤倉赤霉菌赤霉素生物合成及代謝調(diào)控研究進展

王冰璇1，司文3，吳燁飛3，張心齊1，汪石瑩1，吳酬飛2，林海萍1，尹良鴻1

1 浙江農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 臨安 311300 2 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000 3 浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司，浙江 海寧 314400

赤霉素是最重要的植物生長調(diào)節(jié)劑之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到越來越廣泛的應(yīng)用，具有廣闊的市場前景，但其工業(yè)化的高生產(chǎn)成本嚴(yán)重制約著它的廣泛應(yīng)用。近年來，利用生物技術(shù)提升赤霉素產(chǎn)量日益成為研究熱點。赤霉素生物合成是多種酶協(xié)同作用的過程，闡明赤霉素的生物合成機制，利用代謝工程策略調(diào)控代謝流量，對提高赤霉素產(chǎn)量至關(guān)重要。文中綜述了當(dāng)前藤倉赤霉菌赤霉素生物合成途徑、關(guān)鍵酶、環(huán)境因素、代謝流調(diào)控等方面的研究進展，在代謝調(diào)控方面進行了展望，以期為實現(xiàn)赤霉素穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)提供思路。

藤倉赤霉菌，赤霉素，生物合成，代謝調(diào)控，關(guān)鍵酶

赤霉素 (Gibberellins，GA) 是一種天然的植物生長調(diào)節(jié)劑，與生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯被稱為植物五大激素[1]。1934年，GA由日本學(xué)者從惡苗病菌的發(fā)酵濾液中得到，并于1938年正式命名為GA。至今已發(fā)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)的GA有136種，總稱赤霉素類 (GAs)[2]。具有生物活性的GA主要有GA1、GA3、GA4、GA7等，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示[3–4]。

研究表明，GA對植物生長具有多種調(diào)控功能，可促進莖的伸長、誘導(dǎo)植株開花、打破種子休眠、增強植物抗性等[6–7]，因而在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、食品釀造等方面有著巨大的應(yīng)用潛力。植物、細(xì)菌和真菌的代謝物中均有GA產(chǎn)生[8–10]，但在微生物體內(nèi)的生理作用尚未研究透徹。

目前GA可通過化學(xué)合成、植物提取和微生物發(fā)酵三種方式獲得。因為前兩種方式成本高、效率低，而微生物發(fā)酵法周期短、效率高，所以微生物發(fā)酵法被廣泛應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)[5]。目前，藤倉赤霉菌(W.為有性態(tài)，無性態(tài)為藤倉鐮孢菌)是工業(yè)生產(chǎn)的主要菌種，國內(nèi)GA3工業(yè)生產(chǎn)水平在1 200–2 000 mg/L，國外深層液態(tài)發(fā)酵可達(dá)到3 900 mg/L[11]，GA4國內(nèi)產(chǎn)量大約在600–800 mg/L[12]，但隨著GA的應(yīng)用越來越廣泛，其產(chǎn)量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，因此探索提高GA產(chǎn)量的方法十分必要。GA的生物合成途徑是一個多種酶參與的復(fù)雜過程，因此對途徑中關(guān)鍵酶及酶基因的研究是實現(xiàn)GA定向調(diào)控必不可少的，再加上基因技術(shù)的不斷發(fā)展，利用基因工程菌生產(chǎn)GA已成為研究熱點。本文就中GA的合成途徑和相關(guān)酶及代謝調(diào)控研究進展進行綜述，以期為提高GA的產(chǎn)量提供思路。

圖1 GA1、GA3、GA4、GA7的化學(xué)立體結(jié)構(gòu)[5]

1 GAs生物合成途徑

中GA的生物合成途徑[13–14]已研究得較為清楚 (圖2)，主要包括3個階段：牻牛兒牻牛兒焦磷酸 (Geranylgeranyl diphosphate，GGPP) 的合成、由GGPP合成GA12醛、GA12醛轉(zhuǎn)化為其他種類的GA。

1.1 GGPP的生物合成

該階段是中GA合成的第一階段，其中GGPP是二萜類化合物的共同合成前體，首先以內(nèi)源乙酰-CoA[4]為底物，在3-羥基-3-甲基-戊二酰CoA (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzymeA，HMG-CoA) 還原酶 (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR) 的催化下生成GA的前體物質(zhì)甲羥戊酸 (Mevalonic acid，MVA)，再生成異戊烯焦磷酸 (Isopentenyl pyrophosphate，IPP)、二甲基丙烯焦磷酸 (Dimethyl allyl pyrophosphate，DMAPP)、牻牛兒基焦磷酸 (Geranyl pyrophosphate，GPP)、法尼基焦磷酸 (Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)，IPP與FPP相接，形成GGPP，這是二萜的共同前體[8]。

圖2 藤倉赤霉菌赤霉素的合成途徑[5,15]

1.2 GA12醛的生物合成

第二階段GA12醛的合成過程中，GGPP經(jīng)過古巴焦磷酸合成酶 (Copalyl pyrophosphate synthase，CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶 (- kaurenesynthase，KS) 的催化，生成內(nèi)根-貝殼杉烯。高度疏水的內(nèi)根-貝殼杉烯在細(xì)胞色素P450-4、P450-1單氧酶的一系列催化下生成內(nèi)根-貝殼杉烯酸、GA12醛[15]。

1.3 GAs的生物合成

在該階段GA可通過P450氧化酶同工酶的氧化，生成一系列不同種類的GA。首先GA12醛在P450-1酶的作用下，經(jīng)羥基化生成GA14醛，之后轉(zhuǎn)化為GA14[16]。GA14由P450-2酶催化轉(zhuǎn)化為GA4[17]，GA4既可以在1,2-去飽和酶的作用下轉(zhuǎn)化成GA7，又可在P450-3酶的作用下轉(zhuǎn)化為GA1。最后，GA7在P450-3酶的作用下生成GA3。

2 調(diào)控GAs合成的關(guān)鍵酶

2.1 3-羥基-3-甲基-戊二酰CoA還原酶 (HMGR)

HMGR是GA生物合成途徑中第一個限速酶，也是GA等萜類代謝過程中的關(guān)鍵調(diào)控位點，催化HMG-CoA形成MVA[18]。Giordano等[19]研究GA、胡蘿卜素合成途徑時發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀 (Lovastatin) 作為該酶的抑制劑，只對GA的積累有作用，卻不影響胡蘿卜素的積累和菌絲生長，說明有兩種不同的合成路徑在該菌株體內(nèi)。通過分子雜交、PCR擴增等表明合成基因是同一的，但存在對Lovastatin的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)障礙。有研究發(fā)現(xiàn)HMGR是由、、這3個基因組成的基因家族所編碼，且基因家族不同成員的表達(dá)量影響MVA途徑中“碳流”的變化，從而造成萜類產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量不同[20]。Albermann等[21]發(fā)現(xiàn)，編碼的HMGR由兩部分組成，分別為具有8個跨膜區(qū)域的疏水性N端結(jié)構(gòu)域和親水性C端結(jié)構(gòu)域，對的C端序列進行超表達(dá)，結(jié)果顯示GA3效價比親本菌株增加260%。MVA途徑存在于所有萜類化合物的合成過程中，穗槐二稀同GA一樣，同屬于萜類化合物，Keasling等[22]通過實驗證明，HMGR是穗槐二稀生成過程中的限速酶，而且在酵母中過表達(dá)tHMGR后，穗槐二烯產(chǎn)量大幅度提高，說明通過增加MVA代謝流可以作為提高GA產(chǎn)量的一個新思路。

2.2 牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合酶 (GGPPS)

GGPPS同HMGR、FPP合成酶 (FPPS) 共同參與調(diào)控GGPP的生成。Tudzynski等[23]敲除編碼GGPPS基因后，發(fā)現(xiàn)該菌株不再合成GA。Albermann等[21]將超表達(dá)，GA總產(chǎn)量增加近135%，說明編碼的GGPPS參與了GA合成的關(guān)鍵步驟。對中GA合成途徑中HMGR、FPPS、GGPPS等基因超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)和超表達(dá)后的菌株GA積累水平急劇降低，可能是過多的前體物質(zhì)引起了該途徑的反饋抑制。

2.3 多功能合酶 (CPS/KS)

CPS/KS作為中的一種多功能合酶，同真菌中其他二萜環(huán)化酶一樣，主要以雙功能環(huán)化酶的形式存在[24]。在真菌中，由編碼的CPS/KS雙功能酶，能夠直接催化兩步環(huán)化反應(yīng)，使GGPP向內(nèi)根-貝殼杉烯轉(zhuǎn)化。而與緊密連鎖，共用一個839 bp的啟動子，這可能更好地促進GGPP合成[25]，而且有研究表明，將兩者同時超表達(dá)，總GA水平可提升111 mg/(L·g)[21]。

2.4 細(xì)胞色素P450酶系

細(xì)胞色素P450酶在植物、動物、細(xì)菌和真菌中廣泛存在，是自然界中含量最豐富、底物譜最廣的催化酶系。Tudzynski等[23]通過PCR技術(shù)、差異基因篩選、限制酶介導(dǎo)的基因重組等方法發(fā)現(xiàn)在中，P450酶與控制GA合成的另外兩個基因、位于同一條染色體上，組成了一個基因簇，但轉(zhuǎn)錄方向并不一樣，該基因簇中，除外，其余均受氮源抑制，如圖3所示。Tudzynski等[26]敲除了、，發(fā)現(xiàn)該敲除株只產(chǎn)生GA4和GA7。敲除，則不再產(chǎn)生GA3和GA7，而GA1和GA4則大幅增加。只敲除，GA4和GA7的產(chǎn)量提高，但產(chǎn)物中不再有GA1和GA3。將和同時敲除，則該菌株只生成GA4，并且其產(chǎn)量比野生型高7–8倍。說明編碼GA4去飽和酶，催化GA4向GA3轉(zhuǎn)化，編碼細(xì)胞色素P450-3單氧酶，催化GA7到GA3和GA4到GA1的反應(yīng)。位于右側(cè)，編碼P450-4單氧酶，該酶催化內(nèi)根-貝殼杉烯生成內(nèi)根-貝殼杉烯[27]。和是共享雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄單元，P450-1單氧酶主要催化內(nèi)根-貝殼杉烯酸到GA14：7β-羥基化、氧化C-6位收縮B環(huán)、3β-羥基化、氧化C-7位，分別轉(zhuǎn)化為內(nèi)根-7α-貝殼杉烯酸、GA12醛、GA14醛、GA14[8]，其中3β-羥基化是代謝調(diào)控或誘變篩選獲得高產(chǎn)GA4+7的最主要途徑[28]。位于的右側(cè)，編碼P450-2單氧酶，可催化GA14C-20位氧化，從而轉(zhuǎn)化為GA4。是唯一不受高濃度氮源抑制的基因，位于最下游，編碼細(xì)胞色素P450-3單氧酶，催化GA7到GA3和GA4到GA1的反應(yīng)[27]。

2.5 谷氨酰胺合成酶 (GS)

谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase，GS) 是藤倉赤霉菌中合成谷氨酰胺的唯一酶，還是參與氨代謝的關(guān)鍵酶。研究表明，高濃度的谷氨酰胺能抑制所有氮源限制基因的表達(dá)，當(dāng)GS被移除后，胞內(nèi)谷氨酰胺處于較低水平，GA合成基因則會大量表達(dá)，導(dǎo)致GA大量合成[29]。然而有研究表明，當(dāng)敲除GS的編碼基因后，GA水平明顯下降，說明涉及赤霉菌的代謝調(diào)控[30]。

2.6 腺苷酸環(huán)化酶 (AC)

腺苷酸環(huán)化酶 (Adenylel cyclase，AC) 是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種生理功能的膜整合蛋白，是調(diào)控真菌中環(huán)腺苷磷酸 (cAMP) 水平的關(guān)鍵酶[31]。大量研究表明，許多絲狀真菌的發(fā)育、生長、抗逆等都受細(xì)胞跨膜信號cAMP轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控[32]。Michielse等[33]與García-martínez等[34]證明，在中，當(dāng)敲除編碼腺苷酸環(huán)化酶基因后，GA產(chǎn)量減少。Studt等[35]發(fā)現(xiàn)，AC被異三聚體G蛋白 (Heterotrimeric G protein) α亞基刺激，合成cAMP后，蛋白激酶A (Pka) 被激活，進而Pka通過對目的蛋白進行磷酸化修飾來改變蛋白活性，調(diào)控代謝過程。

圖3 藤倉赤霉菌中赤霉素生物合成基因簇[15]

3 調(diào)控GAs合成的環(huán)境因素

微生物培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)條件的變化均會引起GA合成代謝過程中關(guān)鍵酶及基因的變化，從而直接或間接調(diào)控著GA的合成代謝。

3.1 營養(yǎng)元素的調(diào)控

3.1.1 碳源

碳源作為微生物生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，一方面為細(xì)胞生長提供必需的物質(zhì)能量，另一方面也為代謝產(chǎn)物提供原料。葡萄糖、淀粉、蔗糖是目前最常使用的碳源，過高的碳源濃度會因代謝抑制而限制GA的合成[36]。González等[37]向培養(yǎng)基中添加淀粉和蔗糖的混合物能大幅提升GA產(chǎn)量。 劉文芳等[38]認(rèn)為液化淀粉是GA發(fā)酵的最優(yōu)碳源。甜菜渣、糖蜜、秸稈等也可為GA生產(chǎn)提供碳源。劉風(fēng)莉等[39]在研究串珠鐮孢菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)GA3時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加酶解后的秸稈，產(chǎn)量能得到有效提高，達(dá)到789.14 mg/kg。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，開始時高濃度的碳源會對GA3的合成產(chǎn)生抑制，但氮源耗盡時少量的碳源補充有利于細(xì)胞生長和GA3積累[40]。可見碳源的種類及比例對赤霉素的產(chǎn)量有明顯的影響，因此可通過合適的碳源配比來提升赤霉素生產(chǎn)水平。

植物油可作為遲效碳源，不僅為微生物生長發(fā)育提供能量，還能緩解中間代謝物的阻遏效應(yīng)。植物油經(jīng)過培養(yǎng)環(huán)境中脂肪酶的分解作用，形成脂肪酸和甘油，其中脂肪酸通過代謝途徑中的β-氧化，形成乙酰輔酶A參與合成。例如莊木坤等[28]認(rèn)為在培養(yǎng)過程中添加芝麻油、橄欖油、豆油能夠提升GA3的效價。在抗生素的生產(chǎn)中，植物油也能提高產(chǎn)物效價，如Park等[41]在頭霉素C的研究過程中發(fā)現(xiàn)，8% (/) 的菜籽油與單一碳源淀粉相比，目的產(chǎn)物產(chǎn)量提高2倍。陳貴斌等[42]發(fā)現(xiàn)以豆油為部分碳源進行頭霉素C發(fā)酵，有利于提高產(chǎn)素能力。將多種植物油加到紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中，可有效提升紅霉素積累水平[43]。

3.1.2 氮源

在的GAs合成途徑中，高濃度的氮水平對GAs合成的影響尤為顯著。Tudzynski等[13]克隆了基因，該基因參與中氮代謝，而且缺失基因的菌株只能利用谷氨酸鹽和銨鹽作為氮源，其GA產(chǎn)量較低。Mihlan等[29]證實編碼的蛋白質(zhì)可以與這6個基因的啟動子結(jié)合。因此，的缺失將會造成這6個受氮調(diào)控基因的表達(dá)水平下降。敲除谷氨酰胺合成酶基因會造成GAs和比卡菌素產(chǎn)量急劇下降，說明有可能也參與GAs的生物合成氮代謝[30]。Wong等[44]發(fā)現(xiàn)，在氮源充足時，areA的活性受與的影響。氮源不足的情況下，敲除會造成GA生物合成途徑中受氮調(diào)控基因的表達(dá)量急劇提升。敲除和則導(dǎo)致GA合成基因不表達(dá)，合成比卡菌素合基因提高。因此，與相互作用，共同參與赤霉菌的氮代謝調(diào)控，且二者不可相互替代[45]。

氮源種類也影響GAs的生物合成。常用的無機氮源有氯化銨、硝酸鉀、硫酸銨，有機氮源有玉米漿粉、蛋白胨[28]、豆粕粉、花生粉等[46]。王衛(wèi)等[47]在培養(yǎng)基中加入不同種類的花生餅粉，結(jié)果表明，冷軋花生粉因含有大量蛋白大分子，而能夠有效提升GA3產(chǎn)量。李明森等[48]在研究GA3固體發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，向含有麩皮玉米面的培養(yǎng)基中分別添加硫酸銨、豆粕粉、花生餅粉、硝酸鉀都使GA3效價降低，這可能是因為額外添加氮源造成營養(yǎng)物質(zhì)消耗、菌體生長過快，限制了培養(yǎng)基的傳熱與溶氧，從而造成GA3效價降低。Lale等[49]研究表明，以小麥蛋白作為氮源，其GA3效價要比脫脂豆粕作為氮源產(chǎn)量要低，但GA4效價卻大幅提高。這說明氮源還可能對酶活性產(chǎn)生作用，從而導(dǎo)致GA種類和產(chǎn)量發(fā)生變化。

3.1.3 無機鹽、氨基酸及其他物質(zhì)

無機鹽不僅為赤霉素積累的提供營養(yǎng)物質(zhì)，為酶活性提供離子，還能控制氧化還原電位，平衡細(xì)胞滲透壓。如儲修云等[50]通過在培養(yǎng)基中添加鎂、硼、磷等提高了GAs的效價產(chǎn)量。氨基酸的種類及濃度影響GA的生產(chǎn)，纈氨酸能降低其產(chǎn)量，少量的酪氨酸、谷氨酸能提高GA生產(chǎn)水平。維生素C也會阻礙GA3的合成[51]。在萜類的研究過程中發(fā)現(xiàn)，添加促進劑或誘導(dǎo)劑也能促進產(chǎn)物合成，如三孢布拉霉菌產(chǎn)番茄紅素的發(fā)酵中，添加β-紫羅酮、青霉素等物質(zhì)后，番茄紅素產(chǎn)量能高達(dá)1.54 g/L[52]。赤霉素也是萜類的一種，但目前赤霉素關(guān)于此方面研究較少，有待于深入探究。

3.2 培養(yǎng)條件

3.2.1 pH

培養(yǎng)基中不同的pH值會影響一些營養(yǎng)物質(zhì)的電離程度，當(dāng)菌體攝取這些營養(yǎng)物質(zhì)時，會造成細(xì)胞內(nèi)一些大分子如核酸、蛋白質(zhì)等酸堿度變化，進而使它們的生物活性發(fā)生改變。微生物的生長和次級代謝產(chǎn)物與pH值有非常重要的關(guān)系。對于GA3的生產(chǎn)，pH值大于6.0，菌株主要產(chǎn)GA4和GA7，小于3.5主要產(chǎn)GA1[14]。一方面可能是因為過高的pH導(dǎo)致GA4和GA7等中間代謝物分泌到胞外而不能再轉(zhuǎn)運回胞內(nèi)繼續(xù)合成終產(chǎn)物GA3，另一方面可能是pH對GAs合成途徑中的酶產(chǎn)生了影響[10]。Bilkay等[53]指出pH為5時，黑曲霉發(fā)酵GA3產(chǎn)量達(dá)到0.25 g/L；當(dāng)pH為3和7時，GAs的產(chǎn)量分別為0.1 g/L和0.15 g/L。李明森等[52]發(fā)現(xiàn)pH為7時固體培養(yǎng)GA3效價最高，為9.832 g/kg。張文宣等[54]在研究GA4+7大罐生產(chǎn)過程中，用流加補氨水替代碳酸鈣進行pH調(diào)節(jié)，結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)pH值能明顯提高GA4+7效價。由此可見，pH會制約GAs的種類及含量，因此在實踐生產(chǎn)中，可通過調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH來指導(dǎo)生產(chǎn)。

3.2.2 溫度

溫度與微生物的生長存活密不可分，不同的溫度可促進不同的酶活性，進而提升目的代謝物的積累速度。有研究指出，用串珠鐮孢、作為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)GA適宜溫度有25 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃[55–58]。Jefferys[59]指出，29 ℃利于產(chǎn)GA3，高于29 ℃效價降低，31–32 ℃時利于菌體生長。Meleigy等[60]認(rèn)為，30 ℃利于串珠鐮孢產(chǎn)GA3，高于30 ℃效價降低，40 ℃抑制GA3積累。Escamilla等[11]研究證明，30 ℃有利于流化床培養(yǎng)固定化產(chǎn)GA。王衛(wèi)等[46]發(fā)現(xiàn)對GA3發(fā)酵過程實施分階段變溫控制策略比恒溫發(fā)酵產(chǎn)量提高了11.14%。因此，在GAs生產(chǎn)過程中，可通過菌株的種類來探究適宜的溫度，從而提高GAs產(chǎn)量。

3.2.3 溶氧

溶氧在微生物代謝中也發(fā)揮著巨大的作用，影響著細(xì)胞還原力NADPH和能量代謝。生長和GA合成過程都要消耗氧氣，因為此途徑中有大量氧化反應(yīng)，如脫氫酶、雙加氧酶、P450單氧酶所參與的反應(yīng)都需要消耗氧氣，所以足夠的溶氧量必不可少[13]。在GAs實際生產(chǎn)中，溶氧控制一般通過增大通氣量、補水、降溫、提高轉(zhuǎn)速、添加表面活性劑、氧載體等方式解決。Borrow等[61]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)體系中通入少量二氧化碳能顯著提升GA3產(chǎn)量，達(dá)到0.62 g/L，而不添加二氧化碳GA3的產(chǎn)量僅0.42 g/L。Machado等[62]在研究固體發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，在72 h之前提供低溶氧 (0.24 L/(h·kg))環(huán)境，之后提供高供氧 (0.72 L/(h·kg)) 環(huán)境，GA3產(chǎn)量可達(dá)到最高。但是發(fā)酵過程中溶氧過高也會因菌體生長過快、副產(chǎn)物的大量生成等原因?qū)е翯As產(chǎn)量降低。

過低溶氧量一方面會造成菌絲體內(nèi)的代謝過程發(fā)生變化，如厭氧呼吸會產(chǎn)生大量的乙酸、乙醇等，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害；另一方面導(dǎo)致pH下降、菌絲體自溶、發(fā)酵終止、效價偏低。因此，在GAs的發(fā)酵過程中，充足的溶氧量至關(guān)重要。

4 調(diào)控GAs合成的代謝流

4.1 阻斷分支途徑關(guān)鍵酶基因調(diào)控

在的GAs合成過程中，可通過敲除分支途徑關(guān)鍵酶基因，從而提高GAs產(chǎn)量，如Wiemann等[63]將藤倉赤霉中編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶 (Phosphopantetheinyl transferase) 的基因敲除，造成聚酮化合物合酶 (PKSs) 和非核糖體縮氨酸合酶 (NRPSs) 活性喪失，從而導(dǎo)致與PKSs和NRPSs相關(guān)的下游代謝反應(yīng)受到阻斷，代謝流向GAs合成途徑轉(zhuǎn)移，使GA效價得到提升。目前，赤霉素在該方向的研究較少，可借鑒相關(guān)萜類化合物的研究作為參考。如番茄紅素作為萜類化合物的一種，且在基因調(diào)控方面研究較為透徹，如Miura等[64]將番茄紅素合成基因轉(zhuǎn)入原本不產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)蛋白假絲酵母后，該菌株開始產(chǎn)生番茄紅素，通過切斷其競爭途徑麥角固醇的代謝通路，并使HMGR過表達(dá)，最終番茄紅素產(chǎn)量提高7倍[65]。

4.2 前體物質(zhì)調(diào)控GAs合成

前體物是指加入到培養(yǎng)基中，能被微生物直接利用或參與目標(biāo)產(chǎn)物的生成，通常有脂肪酸、檸檬酸、糖類、C1化合物等一些初級代謝產(chǎn)物。

微生物在經(jīng)過長期的進化演變，其代謝通常不產(chǎn)生多余的物質(zhì)，調(diào)控點通?？刂瞥跫壌x分支首個酶的活性或合成，而添加前體物可以令次級代謝過程避開初級代謝對目標(biāo)產(chǎn)物的調(diào)控。

但前體物的添加濃度不可過高，對菌有毒害作用，從而影響目標(biāo)代謝物產(chǎn)量，過低則作用不顯著。因此，前體物調(diào)控策略的研究對實現(xiàn)GAs高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)十分必要。Cihangir[66]以MVA作為前體物加到浸沒培養(yǎng)的黑曲霉中，探究MVA對該菌的生長和GA3產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)添加少量MVA使GA3的產(chǎn)量提高近50 mg/L。王衛(wèi)等[67]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加草酰乙酸、維生素B2、葡萄糖酸鈣能夠大大提高GA3產(chǎn)量。目前，前體物質(zhì)影響GA合成的相關(guān)研究較少，可通過其他萜類物質(zhì)的相關(guān)研究，為提高GAs產(chǎn)量提供思路，如萜類化合物紫杉醇的培養(yǎng)過程中，添加前體物苯甲酸鈉、乙酸鈉、苯丙氨酸可有效促進紫杉醇的生成產(chǎn)量，產(chǎn)量最高可達(dá)242.6 g/L[68]。

5 總結(jié)與展望

近年來，隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，產(chǎn)GAs的合成途徑已逐漸清晰，合成途徑中的大部分關(guān)鍵酶基因的功能也都研究得較為深入，但在代謝調(diào)控機制方面，前體物代謝調(diào)控方面研究不夠深入，還有待于進一步探索。本課題組致力于中GA4的前體物代謝調(diào)控研究，發(fā)現(xiàn)前體物對GA4效價提高有顯著影響。

目前GA的生產(chǎn)主要通過液態(tài)深層發(fā)酵來實現(xiàn)，但GA需求日益增長與工業(yè)生產(chǎn)的高成本形成了尖銳的矛盾。因此，一方面可利用代謝工程對GA合成途徑進行分子改造，獲得GA種類單一、穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的工程菌株；另一方面可通過宏觀代謝調(diào)控發(fā)酵工藝優(yōu)化方式提高GA產(chǎn)量，具體體現(xiàn)在以下3個方面：1) 轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的細(xì)胞代謝流。通過對基因和基因簇的克隆、定點敲除、同源重組、定向誘變等方式構(gòu)建新的細(xì)胞代謝流，提高GA積累水平。目前，用于GA生產(chǎn)的菌主要是和串珠鐮刀菌。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌[69]、解淀粉芽孢桿菌[70]、草螺菌[71]等細(xì)菌也能產(chǎn)生GA，但目前能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)菌還未見報道。而且除GA外，其他萜類化合物如β-胡蘿卜素、青蒿素等均在構(gòu)建工程菌株展開了深入研究。因此，可以借鑒其他萜類化合物的研究思路作為后續(xù)深入探究提升GA產(chǎn)量的新方向。2) 增加GA合成代謝流。一方面可以通過改造和調(diào)控微生物內(nèi)源代謝途徑，提高限速酶的表達(dá)量。另一方面可以直接在發(fā)酵過程中添加前體物，王衛(wèi)等[69]在培養(yǎng)基中添加L-異亮氨酸、草酰乙酸、MVA等合成前期的小分子物質(zhì)，較添加單一前體MVA，GA3產(chǎn)量提高了11.6%。目前通過該方面進行調(diào)控GA產(chǎn)量的研究相對較少可進行深入探究。3) 發(fā)酵工藝優(yōu)化。首先可以通過分析中GA代謝調(diào)控機制，微觀為思路，宏觀為導(dǎo)向，對菌株最適生長條件進行優(yōu)化；其次創(chuàng)新開發(fā)新型的發(fā)酵方式，滿足GA的商業(yè)需求。

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Research progress in biosynthesis and metabolism regulation of gibberellins in

Bingxuan Wang1, Wen Si3, Yefei Wu3, Xinqi Zhang1, Shiying Wang1, Choufei Wu2, Haiping Lin1, and Lianghong Yin1

1,,’311300,,2,,313000,,Zhejiang Qianjiang Biochemical CoLtdHainingZhejiangChina

Gibberellin is one of the most important plant growth regulators, and widely used in agricultural production. However, the high cost of gibberellins production is restricting its efficient application. In recent years, biotechnological innovations have improved the synthesis of gibberellin. Gibberellin biosynthesis requires various enzymes. Current research focuses on the biosynthetic mechanisms of gibberellin and the metabolic engineering techniques to improve the production of gibberellin. This paper reviews the current research on gibberellin biosynthesis pathway, the key and enzymes environmental factors involved, and the metabolic regulation of gibberellin in, summarizes the application of metabolic regulation in gibberellin biosynthesis, to provide the basis for achieving stable gibberellins production.

, gibberellins, biosynthesis, metabolic regulation, key enzyme

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May14, 2019;

July25, 2019

Supported by: Sub-project of National Key Research and Development Program (No. 2017YFD0201302-04), Collabrative Innovation Center of Zhejiang Green Pesticide Open Fund Programs (No. LSNY201815).

Haiping Lin. Tel: +86-571-63732757; Fax: +86-571-63740809; E-mail: zjlxylhp@163.comLianghong Yin. Tel:+86-571-63732757; E-mail: ylh4@163.com

10.13345/j.cjb.190194

國家重點研發(fā)計劃 (No. 2017YFD0201302-04)，浙江省綠色農(nóng)藥2011協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金 (No. LSNY201815) 資助。

2019-08-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190805.1053.001.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)