朱丹妮，楊佳蕾，吳詩坡，李瑤，陳旖，張金龍，宋小紅，侯利華

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071；

2.國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100070

視神經(jīng)源于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突匯集而成[1]。視神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，由于其解剖學(xué)上的特殊性，常被用于研究中樞神經(jīng)的損傷和再生[2]。

視神經(jīng)損傷（optic nerve crush，ONC）后，軸突難以自行再生[3]，導(dǎo)致視功能出現(xiàn)不可逆的損失。ONC動(dòng)物模型的建立有很多方式，包括橫斷損傷、牽拉損傷、擠壓損傷、擊打頭部損傷等。視神經(jīng)橫斷損傷模型是一種致傷量穩(wěn)定的模型，但該模型將視神經(jīng)完全切斷，損傷嚴(yán)重，容易傷及眼動(dòng)脈造成大出血，后續(xù)模型研究評(píng)價(jià)有一定局限性；牽拉法損傷模型手術(shù)步驟多、操作繁瑣且創(chuàng)口較大；擊打頭部建立的損傷模式與臨床損傷較為接近，但造模成功率低，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致死率較高。常用的視神經(jīng)夾傷損傷模型有鉗夾傷、球囊擠壓傷和精細(xì)鑷夾傷。鉗夾傷可控性好，損傷明確，但不易精確定量，創(chuàng)口較大，適用于兔子和大鼠動(dòng)物模型[4]；球囊擠壓傷易于操作但需要開顱，創(chuàng)傷較大，且致傷量不易控制[5]；精細(xì)鑷夾傷對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的創(chuàng)傷較輕，神經(jīng)髓鞘完整且創(chuàng)口較小。C57BL/6小鼠常被用做病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[6-7]，選擇精細(xì)鑷擠壓夾傷建立小鼠損傷模型，采用靠近角膜的結(jié)膜切口暴露視神經(jīng)建模，可避開眼底靜脈竇進(jìn)行夾傷手術(shù)，減少手術(shù)出血，成本低且操作方便，易于大量開展研究工作。

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促軸突生長雙重功能的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族成員，在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)形成、發(fā)育、正常功能維持和損傷后恢復(fù)中起至關(guān)重要的作用[8-11]。NGF對(duì)損傷中樞神經(jīng)的保護(hù)作用主要包括增加自由基活性[12]、減少凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)纖維的存活[13-14]、調(diào)節(jié)鈣通道穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平[15]等。與鼠源NGF不同，重組人神經(jīng)生長因子（recombinant human NGF，rhNGF）利用中國倉鼠卵巢（chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)制備[16]，生產(chǎn)模式不受動(dòng)物原料限制，不存在異源蛋白污染[17]。用rhNGF滴眼液治療ONC的保護(hù)效果尚有待建立動(dòng)物模型予以評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周雄性C57BL/6小鼠購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；rhNGF由本實(shí)驗(yàn)室制備；Triton X-100購自Sigma公司；DAPI Fluoromount-G購自Southern Biotech公司；Anti-RBPMS Antibody購自Millipore公司；Goat anti-Rabbit IgG（H+L） ALEXA FLUOR Plus 594購自Invitrogen公司；杜蒙5號(hào)鑷（11251-30，F(xiàn).S.T）；顯微器械（六六視覺）；體視顯微鏡（Leica，M80）；小動(dòng)物麻醉機(jī)（瑞沃德，R540IP）；熒光顯微鏡（BioTek，CYTATION1）。

1.2 建立ONC模型

小鼠用麻醉機(jī)誘導(dǎo)麻醉，固定在麻醉面罩手術(shù)板上，0.9%氯化鈉注射液清洗雙眼。在近眼尾側(cè)下方眼瞼位置剪開球結(jié)膜，用顯微眼用鑷鈍性分離結(jié)膜暴露視神經(jīng)。用杜蒙5號(hào)鑷在眼球后2 mm處垂直視神經(jīng)夾持視神經(jīng)5 s，右眼不做處理。夾傷后將切開的球結(jié)膜復(fù)位，觀察術(shù)后情況：左眼瞳孔散大而右眼瞳孔對(duì)光反射正常，雙眼眼底無出血血供恢復(fù)正常，涂抹紅霉素眼膏預(yù)防感染。

將14只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為夾傷5 s組和夾傷10 s組，觀察不同夾傷時(shí)長對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）存活的影響。

將30只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為5組，即正常組和夾傷后第7、14、21、28 d組，觀察各時(shí)間點(diǎn)RGCs的存活率。

整個(gè)損傷過程由同一人完成，以保證夾傷視神經(jīng)的方向和力度的一致性。

1.3 rhNGF滴眼液給藥

將8只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為2組，即夾傷后損傷眼滴0.9%氯化鈉注射液（對(duì)照組）或90 μg/mL rhNGF（治療組），夾傷后第14 d取視網(wǎng)膜計(jì)數(shù)RGCs，計(jì)算存活率。從術(shù)后第2 d開始每天早晚2次滴眼給藥，連續(xù)給藥13 d，所有視神經(jīng)損傷小鼠麻醉機(jī)麻醉后進(jìn)行左眼滴眼液給藥，5 μL滴眼液給藥后小鼠迅速放回籠內(nèi)并觀察小鼠蘇醒后的狀態(tài)。

1.4 取材

小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，暴露心臟，經(jīng)左心室注射0.9%氯化鈉注射液、4%多聚甲醛固定，在體視顯微鏡下將眼球剪下浸泡在4%多聚甲醛固定液中固定。

1.5 視網(wǎng)膜鋪片和封片計(jì)數(shù)

眼球在4%多聚甲醛中固定后，PBS清洗，在體視顯微鏡下將視網(wǎng)膜從眼球上分離，將視網(wǎng)膜分成鼻側(cè)、顳側(cè)、腹側(cè)、背側(cè)4個(gè)象限。將多重剪接RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein with multiple splicing，RBPMS）稀釋后，于4℃孵育視網(wǎng)膜過夜；PBS洗滌后免疫熒光二抗避光室溫孵育2 h，加入DAPI Fluoromount-G封片。熒光顯微鏡下，沿每一象限的中線，距視盤凹陷處0.5、1、1.5 mm處各選一區(qū)域，4個(gè)象限分別采圖，每張視網(wǎng)膜各采圖12張。用Photoshop軟件為每張圖片畫定 0.09 mm2（0.3 mm×0.3 mm）的計(jì)數(shù)區(qū)，用 Image J軟件對(duì)每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)進(jìn)行節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)[18]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism軟件進(jìn)行制圖和數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析法（One Way ANOVA），P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠ONC模型的建立與評(píng)價(jià)

2.1.1 正常小鼠視網(wǎng)膜RGCs的分布 小鼠整個(gè)視網(wǎng)膜免疫熒光檢測(cè)可觀察到其整體形態(tài)。小鼠RGCs分布在整個(gè)視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中，RBPMS鋪染結(jié)果顯示RGCs分布均勻且呈放射狀排列，視網(wǎng)膜血管呈網(wǎng)狀分布于視網(wǎng)膜中，血管處無RBPMS陽性細(xì)胞分布（圖1）。整個(gè)視網(wǎng)膜鋪染結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，熒光顯微鏡下可觀察到視網(wǎng)膜視盤中心區(qū)域RBPMS陽性細(xì)胞分布密集，視網(wǎng)膜邊緣RBPMS陽性細(xì)胞分布較稀疏。

圖1 正常小鼠視網(wǎng)膜鋪染

2.1.2 ONC小鼠視網(wǎng)膜RGCs評(píng)價(jià) 夾傷5 s組和夾傷10 s組在損傷后第7 d的RGCs數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0173），5 s組的RGCs數(shù)量顯著高于10 s組（圖2）。夾傷5 s組小鼠血供正常且晶體未見渾濁，夾傷10 s組有2只小鼠眼球萎縮至正常小鼠的2/3大小且晶狀體渾濁，可能是夾傷時(shí)間太長導(dǎo)致眼動(dòng)脈損傷[20]，視網(wǎng)膜血供不足缺乏營養(yǎng)從而導(dǎo)致隨后的萎縮，視網(wǎng)膜上出現(xiàn)絮狀異物，RBPMS鋪染無法進(jìn)行。夾傷5 s組小鼠血供正常，晶體未見渾濁，故選擇夾傷時(shí)間為5 s進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同夾傷時(shí)間組小鼠視網(wǎng)膜鋪染及細(xì)胞計(jì)數(shù)

損傷后第7、14、21、28 d，以正常組RGCs數(shù)目作為對(duì)照，計(jì)數(shù)結(jié)果顯示損傷后各時(shí)間點(diǎn)RGCs差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=962.5，P＜0.0001）。任意2組間采用Tukey法比較，損傷后第7、14、21、28 d組小鼠視網(wǎng)膜中RGCs數(shù)目均明顯低于正常組（圖3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）；損傷后第21 d組和損傷后第28 d組小鼠視網(wǎng)膜RGCs數(shù)目比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.13）。視神經(jīng)夾傷后第7、14、21、28 d的RGCs存活率分別為50.38%、23.12%、18.02%、14.53%（圖3），提示在沒有治療干預(yù)情況下，ONC后小鼠RGCs存活率持續(xù)下降。

圖3 不同觀察時(shí)間點(diǎn)小鼠視網(wǎng)膜鋪染及細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.2 rhNGF滴眼液治療ONC的初步評(píng)價(jià)

ONC模型建立后，給予小鼠患側(cè)眼睛rhNGF滴眼液（治療組）或0.9%氯化鈉注射液滴眼液（對(duì)照組）滴眼。ONC后第14 d小鼠視網(wǎng)膜RGCs計(jì)數(shù)結(jié)果提示，治療組與對(duì)照組的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009），治療組RGCs數(shù)目相較于對(duì)照組多26.8%（圖4），提示rhNGF滴眼液能夠?qū)A傷后的視神經(jīng)提供一定的保護(hù)作用，提高RGCs的存活率。

圖4 治療組與對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜鋪染及細(xì)胞計(jì)數(shù)

3 討論

視神經(jīng)纖維受到的機(jī)械壓迫阻礙了軸漿運(yùn)輸，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝受損，視神經(jīng)纖維失去營養(yǎng)及周圍組織的保護(hù)而發(fā)生進(jìn)一步損害，導(dǎo)致視神經(jīng)無法修復(fù)[20]。視神經(jīng)損傷后RGCs凋亡是造成視功能不可逆損害的根本原因。通過擠壓夾傷法可以模擬機(jī)械壓迫建立小鼠視神經(jīng)損傷模型，并通過RGCs數(shù)目變化對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

文獻(xiàn)中對(duì)視神經(jīng)的夾傷時(shí)間有不同的選擇。Li等[21]使用杜蒙5號(hào)鑷選擇在視盤后面大約1 mm處擠壓5 s；Wang等[22]用杜蒙5號(hào)細(xì)鑷在視盤后約1 mm處擠壓5 s；Moore等[23]用杜蒙5號(hào)鑷在眼后1 mm處壓碎神經(jīng)10 s。本研究中分別做了夾傷5 s和夾傷10 s的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。夾傷10 s組有2只小鼠眼球萎縮且晶狀體渾濁，視網(wǎng)膜上出現(xiàn)絮狀異物，RBPMS鋪染無法進(jìn)行，夾傷5 s組小鼠血供正常晶體未見渾濁，故選擇夾傷時(shí)間為5 s進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本研究采用RBPMS作為RGCs計(jì)數(shù)的標(biāo)志。RBPMS是RNA結(jié)合蛋白家族成員，主要定位于RGCs的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，是哺乳動(dòng)物RGCs的選擇性標(biāo)記物[24]。研究表明，RBPMS優(yōu)于其他識(shí)別RGCs的標(biāo)志物，包括細(xì)胞骨架、核蛋白及神經(jīng)活性肽等，主要原因是在視網(wǎng)膜40個(gè)RGCs亞群中RBPMS均高度表達(dá)[19]。將視神經(jīng)夾傷后，軸漿運(yùn)輸受阻導(dǎo)致RGCs存活率隨時(shí)間減少，損傷后第28 d僅剩14%的RGCs存活，證明損傷模型建立成功。

意大利Dompé Farmaceutici S.p.A.公司開發(fā)了在大腸桿菌中生產(chǎn)的rhNGF局部制劑，可用于眼部疾病[25]。Di Zazzo等[26]的研究證實(shí)該rhNGF滴眼液治療后，神經(jīng)營養(yǎng)性角膜病變患者的角膜敏感性得到改善，8周后實(shí)現(xiàn)了完全的角膜愈合。Sacchetti等[27]證實(shí)rhNGF可通過抑制凋亡來促進(jìn)色素性視網(wǎng)膜炎大鼠視網(wǎng)膜總感光細(xì)胞存活。在視神經(jīng)損傷方面，臨床前研究的大鼠模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，高濃度 rhNGF（180、540 μg/mL）對(duì)視神經(jīng)夾傷損傷具有一定的修復(fù)作用，損傷14 d后，給藥組相較于空白對(duì)照組RGCs多50%左右，但2個(gè)濃度間RGCs沒有差異[28]。同時(shí)，rhNGF治療神經(jīng)營養(yǎng)性角膜炎的臨床研究顯示，高劑量給藥組臨床患者的不良反應(yīng)較重，主要表現(xiàn)為眼部疼痛及瞼炎[29]。目前，較低濃度的rhNGF對(duì)小鼠模型的視神經(jīng)損傷修復(fù)作用未見報(bào)道。原核系統(tǒng)表達(dá)的rhNGF比活性低，真核表達(dá)系統(tǒng)可克服錯(cuò)誤折疊的問題，蛋白比活性和穩(wěn)定性較好。因此，我們使用ONC模型初步評(píng)價(jià)了CHO細(xì)胞來源的rhNGF滴眼液對(duì)擠壓損傷后的視神經(jīng)損傷小鼠的治療效果，結(jié)果顯示給藥13 d后，90 μg/mL rhNGF治療組的RGCs數(shù)目顯著高于對(duì)照組，提示外源性給予rhNGF可以提高小鼠RGCs存活率，發(fā)揮保護(hù)性作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠建立了視神經(jīng)夾傷損傷模型，具有操作便捷、創(chuàng)傷較輕、重復(fù)性好的特點(diǎn)，并基于此初步評(píng)價(jià)了rhNGF滴眼液治療ONC的保護(hù)作用，為進(jìn)一步探討rhNGF治療機(jī)制及藥效評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。