王雨琪，鄭幽，蔣曉祎，孫強，江紅

1.北京交通大學 理學院生命科學與生物工程研究院，北京 100044；2.軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100071

細胞培養(yǎng)和保種技術(shù)廣泛用于生命科學研究的各個領(lǐng)域，如疫苗研制、人工器官和再生醫(yī)學等。冷凍保存是目前細胞長期保存的通用方法，有利于降低細胞被微生物污染和細胞之間交叉污染的風險，并且能夠減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變，避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。然而，細胞的凍存和復蘇過程會對細胞造成較大損傷，降低細胞膜中的脂質(zhì)含量，產(chǎn)生過氧化，同時影響細胞的結(jié)構(gòu)和代謝途徑[1-3]。因此，凍存液作為細胞在低溫狀態(tài)下的保護介質(zhì)，其作用尤為重要。

自Polge等發(fā)現(xiàn)細胞凍存液中添加甘油可提升細胞復蘇后的存活數(shù)量，越來越多的實驗致力于研究細胞的低溫保護。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）就是細胞低溫保護介質(zhì)中的一種，DMSO可以有效降低細胞內(nèi)的水分子含量，從而降低結(jié)晶形成的概率，減少細胞損傷[4-5]。目前應(yīng)用最廣的細胞凍存液是DMSO與胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的混合溶液，然而FBS價格昂貴，不適宜大量凍存使用。

本研究旨在探討細胞短期凍存液的優(yōu)化配方。我們以多種貼壁細胞及懸浮細胞為研究對象，觀察分析不同血清含量的凍存液對細胞復蘇狀態(tài)和生長速度可能存在的影響，為細胞培養(yǎng)和留種等操作提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

貼壁細胞系人乳腺癌上皮細胞株MCF-7和人鼻咽上皮細胞株NP-69，懸浮細胞系人急性白血病淋巴細胞株CCRF、人T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat和人慢性髓原白血病細胞K-562細胞株均由本課題組保存；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購自Macgene公司；胎牛血清購自康源公司；DMSO購自北京伊諾凱科技有限公司；臺盼藍購自Procell公司。

1.2 凍存液配制

按不同配比（體積分數(shù)）配制細胞凍存液［A組：10%DMSO+10%FBS+80%DMEM/1640培養(yǎng)基；B組：10%DMSO+20%FBS+70%DMEM/1640培養(yǎng)基；C組：10%DMSO+50%FBS+40%DMEM/1640培養(yǎng)基；D組：10%DMSO+90%FBS］，吹打混勻后于4℃保存。

1.3 貼壁細胞凍存

取正常連續(xù)培養(yǎng)且狀態(tài)良好的貼壁細胞，棄去上清，用PBS沖洗2～3次，加入胰蛋白酶于37℃消化完全后取出，用含10%FBS及1%青鏈霉素混合液的DMEM混合培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，將中和后的混合液分為4組并以1000 r/min離心收集細胞，分別用不同配比的凍存液重懸，放入程序降溫盒中（平均降溫速率-1℃/min），-80℃凍存。

1.4 懸浮細胞凍存

1000 r/min低速離心收集正常連續(xù)培養(yǎng)且狀態(tài)良好的懸浮細胞，棄上清后用PBS重懸，分為4等份后再次離心收集細胞，分別用不同配比的凍存液重懸，放入程序降溫盒中，-80℃凍存。

1.5 細胞復蘇及培養(yǎng)

-80℃凍存4 d后，取出程序降溫盒中的凍存管迅速放到預熱至37℃的水浴鍋中，融化完全后分別離心，棄去凍存液，分別以適量含10%FBS及1%青鏈霉素的DMEM和1640混合培養(yǎng)基重懸細胞，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)。根據(jù)細胞正常狀態(tài)下不同的生長速度，分別取NP-69、Jurkat和K-562細胞5×104個，MCF-7和CCRF細胞1×105個接種于12孔板，每組細胞設(shè)3個復孔，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.6 細胞形態(tài)觀察

用倒置熒光顯微鏡在20×鏡下分別拍攝復蘇后24、30、48、72、96 h時細胞的生長狀態(tài)，對比貼壁細胞的貼壁情況及懸浮細胞的成團情況，以及視野中細胞碎片和雜質(zhì)的數(shù)量。

1.7 細胞增殖速率分析

細胞復蘇培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化貼壁細胞，以DMEM混合培養(yǎng)基中和，1000 r/min離心3 min，棄上清，制備單細胞懸液。懸浮細胞連同培養(yǎng)基吸出后1000 r/min離心3 min，同樣棄去上清制備單細胞懸液。取9 μL細胞懸液加入1 μL 0.4%臺盼藍溶液至終濃度0.04%，染色3 min后用血球計數(shù)板計數(shù)，記錄活細胞數(shù)目。以上述同種方法在復蘇培養(yǎng)后48、72、96 h分別重復1次臺盼藍染色計數(shù)，繪制細胞生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 不同配方的凍存液對貼壁細胞短期凍存后生長形態(tài)的影響

細胞復蘇24 h后，D組MCF-7細胞貼壁能力稍差，A、B組復蘇后貼壁能力較好。30 h后，A組細胞貼壁效果明顯優(yōu)于其他3組，48 h后4組細胞基本全部貼壁，視野中無明顯細胞死亡，截至96 h，4組細胞復蘇后的形態(tài)及大小無明顯差異（圖1A）。類似地，NP-69細胞復蘇后，A組貼壁效果較好于其他3組，且在D組觀測到少量細胞碎片，96 h內(nèi)4組細胞復蘇后的形態(tài)及大小也無明顯差異（圖1B）。提示，對于貼壁細胞的短期凍存，凍存液中不同血清含量對細胞活力無顯著影響，低濃度血清含量（10%）即可維持短期凍存時貼壁細胞的生長活力。

圖1 貼壁細胞在96 h內(nèi)的生長狀態(tài)

2.2 不同配方的凍存液對貼壁細胞短期凍存后增殖能力的影響

根據(jù)0、24、48、72和96 h記錄的細胞數(shù)目繪制生長曲線，結(jié)果如圖2，MCF7和NP-69細胞在用不同配方的凍存液短期凍存后，細胞生長速度無明顯差異，提示，對貼壁細胞的短期凍存，凍存液中血清含量的變化對細胞增殖無顯著影響，低濃度的血清含量（10%）即可維持短期凍存時貼壁細胞的增殖能力。

圖2 貼壁細胞在96 h內(nèi)的生長速度

2.3 不同配方的凍存液對懸浮細胞短期凍存后生長形態(tài)的影響

復蘇24 h后拍照觀察，4組均有懸浮細胞聚集形成的細胞團，但隨著血清濃度降低，復蘇后細胞死亡增多，細胞狀態(tài)變差，細胞碎片增多。單獨的懸浮細胞形態(tài)圓潤，無明顯差異，而不同的懸浮細胞形成的細胞團差異較大。

低血清濃度（A、B組）凍存液中復蘇的CCRF細胞易形成較大細胞團，隨著細胞死亡增多，漂浮的細胞碎片增多，細胞團數(shù)量減少，高血清濃度（C、D組）凍存液中復蘇的CCRF細胞則較少形成大細胞團（圖3A）。相反，高血清濃度凍存的Jurkat細胞在復蘇后較易形成細胞團，且成團細胞數(shù)量較高于低濃度組（圖3B）。而K-562細胞中少見大細胞團，多為20個細胞以內(nèi)的較小細胞團，且在高血清濃度凍存液中復蘇的K-562細胞有較多小細胞團形成（圖3C）。

圖3 懸浮細胞在96 h內(nèi)的生長狀態(tài)

結(jié)果提示，對于懸浮細胞的短期凍存，凍存液中不同血清含量對細胞活力影響顯著，高濃度血清含量對維持短期凍存時懸浮細胞的生長活力有著關(guān)鍵作用，F(xiàn)BS∶DMSO為9∶1的比例最優(yōu)。

2.4 不同配方的凍存液對懸浮細胞短期凍存后增殖能力的影響

如圖4所示，用90%血清凍存液凍存的CCRF細胞（D組）在復蘇后96 h內(nèi)，其生長速度和數(shù)量明顯優(yōu)于其他配方。在Jurkat和K-562細胞中，高血清濃度的凍存液（C、D組）效果也優(yōu)于低血清濃度凍存液（A、B組）。復蘇后48 h內(nèi)，C組中Jurkat和K-562細胞生長速度最快，截至復蘇后96 h，D組中Jurkat和K-562細胞增殖數(shù)量最多。

圖4 懸浮細胞在96 h內(nèi)的生長速度

結(jié)果提示，對懸浮細胞的短期凍存，凍存液中血清含量的變化對細胞增殖有顯著影響，血清含量越高越利于維持懸浮細胞短期凍存時的增殖能力，F(xiàn)BS∶DMSO為9∶1的比例最優(yōu)。

3 討論

細胞培養(yǎng)是大量實驗開展的基礎(chǔ)，建立安全有效的凍存及復蘇方法是細胞培養(yǎng)的前提和基礎(chǔ)。為了減少胎牛血清的潛在風險，節(jié)約經(jīng)費，同時保證理想的凍存與復蘇效果，本研究配置了4種不同血清濃度的凍存液并進行對比實驗。實驗結(jié)果表明，對于貼壁細胞，凍存液中的血清含量對復蘇后細胞形態(tài)及生長增殖無明顯影響；而對于懸浮細胞，隨著血清濃度降低，復蘇后細胞生長增殖能力明顯減弱。綜上，對于貼壁細胞的短期凍存與復蘇，出于節(jié)約和風險性考慮，推薦使用10%血清含量的凍存液；而對于懸浮細胞的短期凍存與培養(yǎng)，出于保證實驗效果的考量，推薦使用90%血清含量的凍存液。

除血清外，不同保護劑種類和降溫方式均有可能影響細胞凍存和復蘇效果。相對于非滲透性凍存保護劑，DMSO作為目前應(yīng)用最廣泛的滲透性保護劑，能有效促進細胞內(nèi)水的玻璃化，降低細胞內(nèi)結(jié)晶造成的細胞損傷。然而，細胞凍存的降溫過程水分子會產(chǎn)生極性運動，在冷凍過程中細胞需充足的時間失水以防止細胞內(nèi)冰晶形成，同時也應(yīng)避免降溫時間過長造成的細胞嚴重脫水損傷，因此在細胞凍存降溫過程中存在最佳降溫速率。目前程序性降溫液氮凍存法已得到廣泛應(yīng)用，本次實驗應(yīng)用程序降溫盒，以-1℃/min的平均降溫速率進行緩慢降溫，此外也可以采用分階段降溫措施，將降溫速率控制在-1～-1.5℃/min，從而減少細胞損傷[6-7]。

需要注意的是，本次實驗旨在探究短期凍存中凍存液對細胞的影響，凍存時間較短，細胞的選擇也較有針對性，因此不能完全用于推斷和模擬長期凍存對不同細胞的影響和損傷。此外，有研究證明用10%、20%、40%和90%血清含量的凍存液在-80℃短期凍存的干細胞，可達到與-196℃液氮低溫凍存相同的效果，同時更加簡便快捷[8]，但是否適用于懸浮細胞仍不明確。

綜上所述，我們分別探討了不同配比的凍存液在短期凍存中對貼壁細胞和懸浮細胞的影響，含有90%血清的凍存液在短期凍存中能更好地保護懸浮細胞，而凍存液中的血清含量對于貼壁細胞影響不大。這一結(jié)果可為貼壁細胞和懸浮細胞的培養(yǎng)和留種等操作提供指導。