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        基于輻射防護(hù)基因集預(yù)測的輻射損傷防護(hù)化合物活性評價(jià)

        2020-03-10 11:49:12賈廣彥劉禎錢坤周喆
        生物技術(shù)通訊 2020年6期
        關(guān)鍵詞:輻射損傷抗輻射骨髓細(xì)胞

        賈廣彥,劉禎,錢坤,周喆

        1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850;2.解放軍960醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250031

        輻射防護(hù)劑是防護(hù)與救治核輻射損傷最為有效和直接的手段之一[1]。隨著電離輻射應(yīng)用領(lǐng)域的增加,輻射防護(hù)藥物需求也愈顯迫切。多年來,各國學(xué)者對人工合成化合物、天然化合物和生物因子在內(nèi)的大量候選藥物進(jìn)行了研究和篩選[2],這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,在尋找高效低毒的輻射防護(hù)劑方面進(jìn)展比較緩慢[3]。

        老藥重利用(也稱藥物重定位)是基于已有的藥物發(fā)現(xiàn)其新用途,因?qū)ζ涠靖弊饔昧私廨^為清楚,因此開發(fā)成功的概率更高,是新藥研發(fā)的有效手段之一[4]。計(jì)算預(yù)測分析和實(shí)驗(yàn)篩選過程是老藥新用研究的兩大方法[5]。本單位多年來從事多組學(xué)數(shù)據(jù)的計(jì)算分析,以探尋已上市藥物新的適用范圍,為新藥研發(fā)提供新的思路方法。任磊[6-7]等利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合輻射損傷特征篩選輻射損傷防護(hù)候選藥物,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證明了巴氯芬、阿米洛利等藥物具有輻射損傷防護(hù)作用,為使用藥物重定位策略尋找有效的輻射損傷防護(hù)藥物提供了有力參考。為從上市藥物中發(fā)現(xiàn)輻射損傷防護(hù)劑,劉禎[8]等利用基于網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞反應(yīng)印記整合文庫(LINCS)計(jì)劃[9]的小分子化合物刺激不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù),構(gòu)建算法評估化合物的輻射損傷防護(hù)作用,預(yù)測出了299種可能具有輻射損傷防護(hù)作用的藥物。本研究對基于輻射防護(hù)基因集預(yù)測的系列化合物中排名靠前的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了藥效學(xué)評價(jià),發(fā)現(xiàn)了具有輻射損傷防護(hù)作用的藥物來那度胺,并進(jìn)一步探討了其輻射損傷防護(hù)作用涉及的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        SPF級雄性 C57BL/6J小鼠,6~8周齡,體重18~22 g,購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,合格證號[SCXK(京)-2019-0010]。

        來那度胺(lenalidomide)、醛脫氫酶-2激動(dòng)劑(ALDA-1)、氨磷?。╓R2721)購自 MedChemExpress公司;全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀為北京寶靈曼陽光科技有限公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

        1.2 30 d存活率實(shí)驗(yàn)

        我們在劉禎[8]等預(yù)測的299種抗輻射藥物中選擇了來那度胺和ALDA-1于動(dòng)物模型上驗(yàn)證其是否具有輻射損傷防護(hù)作用。C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院SPF級動(dòng)物房,相對濕度為50%±10%,12 h燈光12 h黑暗,喂常規(guī)飼料,自由飲水。實(shí)驗(yàn)前3 d觀察有無異常。小鼠按體重隨機(jī)分為輻射對照(等容生理鹽水)組、WR2721(150 mg/kg)組(陽性對照)、來那度胺(200 mg/kg)組、ALDA-1(5 mg/kg)組,每組10只。2種藥物溶媒為分析純DMSO。每日腹腔注射給藥1次,給藥5 d。WR2721組照射前30 min腹腔注射給藥。末次給藥后用60Co γ射線(軍事醫(yī)學(xué)研究院鈷源)對各組小鼠進(jìn)行一次性全身照射,照射劑量8 Gy,照射劑量率為69.27 cGy/min。照射后30 d觀察各組小鼠生存情況。

        1.3 外周血白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞測定

        由于來那度胺輻射損傷防護(hù)效果較好,后續(xù)實(shí)驗(yàn)對其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。C57BL/6J小鼠按體重隨機(jī)分為輻射對照(等容生理鹽水)組、WR2721(150 mg/kg)組(陽性對照)、來那度胺(200 mg/kg)組,每組10只,每日腹腔注射給藥1次,給藥5 d。WR2721組照射前30 min腹腔注射給藥。末次給藥后用60Co γ射線對各組小鼠進(jìn)行一次性全身照射,照射劑量6.5 Gy,劑量率為68.33 cGy/min。另取10只同齡C57BL/6J小鼠作為正常組。

        照射后第4、7、11、18、21 d照射各組與正常組小鼠尾靜脈取血20 μL,加入3%檸檬酸鈉2 μL抗凝后用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞數(shù)量。

        1.4 骨髓病理分析

        上述6.5 Gy60Co γ射線照射各組與正常組小鼠各2只于照后第14 d取股骨,剔除股骨附著的軟組織,置于4%多聚甲醛固定液中,16 h后常規(guī)脫水,浸蠟,石蠟包埋,切片,HE染色后在200倍顯微鏡下觀察骨髓造血組織情況并攝像。

        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

        采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析,白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞數(shù)量以x±s表示,采用方差分析(One-Way ANOVA)或秩和檢驗(yàn)。動(dòng)物存活率采用生存分析Log Rank檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 來那度胺對輻射小鼠30 d生存率的影響

        經(jīng)8 Gy60Co γ射線照射后30 d,輻射對照組小鼠存活率為50%,ALDA-1和來那度胺組小鼠存活率為100%(圖1),說明預(yù)測結(jié)構(gòu)來那度胺、ALDA-1在動(dòng)物模型上具有較好的輻射損傷防護(hù)作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們針對來那度胺的輻射損傷防護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究。

        圖1 來那度胺對致死劑量輻射損傷小鼠的保護(hù)作用

        2.2 來那度胺對輻射損傷小鼠白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

        經(jīng)6.5 Gy60Co γ射線照射后,各組小鼠的血液生化指標(biāo)均顯著降低并且隨時(shí)間有不同程度的回升。與輻射對照組相比,來那度胺組和陽性對照組小鼠白細(xì)胞數(shù)量回升更早,照射后第11 d輻射對照組小鼠白細(xì)胞數(shù)量還在降低,而來那度胺組和陽性對照組已顯示出白細(xì)胞的恢復(fù),照射后第21 d各組小鼠白細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)至相近水平,以來那度胺組略優(yōu),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。來那度胺組和陽性對照組照射后淋巴細(xì)胞回升趨勢好于輻射對照組,相比差異顯著(P<0.05)(表2)。在血小板回升過程中,來那度胺組和陽性對照組不僅回升趨勢好于輻射對照組,并且第21 d恢復(fù)程度也明顯優(yōu)于輻射對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)??梢妬砟嵌劝房蓽p少白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞數(shù)量下降的程度,并有助于其恢復(fù)。

        表1 來那度胺對輻射小鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響

        表2 來那度胺對輻射小鼠淋巴細(xì)胞百分比的影響

        表3 來那度胺對輻射小鼠血小板數(shù)量的影響

        2.3 來那度胺對輻射小鼠骨髓脂肪化和細(xì)胞增生的影響

        HE染色切片(圖2)顯示,正常組小鼠股骨骨髓未見脂肪滴,細(xì)胞分裂活躍,細(xì)胞增生明顯,骨髓細(xì)胞排列緊密;輻射對照組小鼠骨髓重度脂肪滴化,內(nèi)有重度出血,骨髓造血細(xì)胞缺乏,細(xì)胞增生不明顯,重度骨髓細(xì)胞耗竭;來那度胺組小鼠股骨骨髓輕度脂肪滴化,骨髓輕度出血,骨髓細(xì)胞增生,輕度骨髓細(xì)胞耗竭;WR2721組小鼠骨髓輕度脂肪滴化,骨髓內(nèi)有輕度出血,骨髓細(xì)胞顯著增生。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示來那度胺可減輕全身照射誘導(dǎo)的小鼠骨髓脂肪化,減少骨髓出血,促進(jìn)骨髓增生,表明其輻射防護(hù)機(jī)制可能涉及保護(hù)小鼠造血系統(tǒng),減輕造血組織的損傷。

        圖2 來那度胺對輻射損傷小鼠骨髓組織形態(tài)的影響(HE×200)

        3 討論

        輻射損傷防護(hù)藥物在國防、反恐、和平利用原子能等方面都有很大價(jià)值[10],經(jīng)過近半世紀(jì)的努力,抗輻射損傷藥物研究已取得一些進(jìn)展,有些藥物已應(yīng)用于臨床,包括氨硫基類化合物、細(xì)胞因子類、激素類、天然藥物等[11]?,F(xiàn)有的輻射損傷防護(hù)作用藥物仍存在許多的問題,如多數(shù)防護(hù)藥物作用單一,無法滿足對中重度急性輻射損傷患者治療的需求[12],有些藥物毒性低但防護(hù)效價(jià)低、有效時(shí)間短[13],有些藥物防護(hù)效價(jià)較高但不良反應(yīng)大[14],因此尋找高效低毒的新型抗輻射藥物仍然具有重要意義。

        藥物重定位是發(fā)掘已知藥物的新用途,探尋其新的適用范圍,由于基于已上市藥物,該策略可降低開發(fā)風(fēng)險(xiǎn),研發(fā)效率高[15]。十幾年來,各類組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展和廣泛應(yīng)用[16],積累了多組學(xué)、多層次的海量數(shù)據(jù),使生物醫(yī)學(xué)進(jìn)入大數(shù)據(jù)時(shí)代,大數(shù)據(jù)分析為發(fā)現(xiàn)新的藥物作用模式[17]、藥物作用機(jī)理辨識(shí)、藥物重定位[18]等提供了新的技術(shù)方法?;谳椛浞雷o(hù)基因集預(yù)測抗輻射藥物,是一種基于化合物或藥物基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)已上市藥物新用途的方法。此模式基于臨床已經(jīng)使用的藥物,其藥物作用特點(diǎn)研究比較充分。本研究對基于輻射防護(hù)基因集預(yù)測的抗輻射藥物的防護(hù)作用進(jìn)行了驗(yàn)證,篩選出具有抗輻射活性的結(jié)構(gòu)來那度胺。來那度胺是第二代免疫調(diào)節(jié)劑,具有抗血管生成、改善免疫功能、腫瘤殺傷和改變骨髓微環(huán)境等多種作用機(jī)制,已上市多年,臨床上用于好幾種血液病的治療[19]。本研究發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物模型上具有輻射損傷防護(hù)作用,提示其進(jìn)一步研發(fā)為輻射防護(hù)劑的可能性。本研究也以實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)依據(jù)證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在抗輻射藥物重定位研究中的有效性,為發(fā)現(xiàn)新型防輻射損傷化學(xué)結(jié)構(gòu)提供了方法學(xué)參考。

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