齊香榮，黃苑，李桐，王培龍，蘇曉鷗

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081

內(nèi)分泌干擾物是干擾人類和動(dòng)物生殖和發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)[1-2]。近年來，雙酚A（bisphenol A，BPA）已廣泛用于聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的制造，并成為應(yīng)用最廣泛的內(nèi)分泌干擾物之一[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，BPA可以通過各種途徑進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)[5-6]，通過發(fā)揮類雌激素活性干擾機(jī)體的正常生理活動(dòng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的毒性作用，包括對(duì)生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等，尤其對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育存在潛在危害[7-9]。這些缺點(diǎn)使得BPA在各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的應(yīng)用受到限制。部分國(guó)家已經(jīng)禁止了BPA在嬰幼兒奶瓶以及食品包裝材料中的使用[10]。在這種情況下，一些BPA替代品在商業(yè)生產(chǎn)中引起了越來越多的關(guān)注。

雙酚芴，學(xué)名9，9-雙（4-羥苯基）芴［9，9-bis（4-hydroxyphenyl）fluorene，BHPF］，是BPA的替代物之一，因其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以提升聚合物的耐熱性，從而被廣泛用于新型聚碳酸酯塑料產(chǎn)品的合成，在航空航天、汽車制造、電子和醫(yī)療器械等行業(yè)中得到普遍應(yīng)用。此外，BHPF也用于與食物接觸材料或容器的生產(chǎn)，用于生產(chǎn)所謂的“不含BPA”的塑料產(chǎn)品。然而，近幾年的研究結(jié)果顯示該化合物也對(duì)人體有潛在危害。Zhang等發(fā)現(xiàn)BHPF存在于“不含BPA”的塑料瓶和人的血清中[11]。此外，BHPF能減輕子宮重量，引起子宮內(nèi)膜萎縮，對(duì)妊娠有不良影響，提示BHPF具有抗雌激素作用；急性接觸BHPF會(huì)導(dǎo)致一系列不良影響，如干擾卵母細(xì)胞成熟、降低卵母細(xì)胞質(zhì)量等[12]，并對(duì)不同物種的卵母細(xì)胞具有廣泛的毒性作用[13]；改變斑馬魚幼魚的睡眠/覺醒行為[14]，引起發(fā)育異常，延緩心臟形態(tài)發(fā)生，損害心臟收縮力，BHPF對(duì)水生生物的安全構(gòu)成不可忽視的威脅[15]；小鼠暴露于BHPF，可在不同階段對(duì)小鼠的神經(jīng)行為造成不同程度的破壞[16]。這些結(jié)果說明動(dòng)物和人類能夠暴露于雙酚芴，且雙酚芴可能會(huì)對(duì)生物體健康產(chǎn)生潛在危害。因此，有必要進(jìn)一步評(píng)價(jià)BHPF在體內(nèi)外的毒性效應(yīng)及毒性機(jī)制，評(píng)估其對(duì)人體的潛在風(fēng)險(xiǎn)，以指導(dǎo)其在工業(yè)生產(chǎn)中的合理應(yīng)用。

常用的毒性評(píng)價(jià)方法有動(dòng)物模型和體外模型2種。體外研究中的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)相比于動(dòng)物模型，具有高通量、低成本的優(yōu)點(diǎn)，并可通過化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖情況探討其雌激素效應(yīng)[17]。MCF-7乳腺癌細(xì)胞雌激素受體表達(dá)陽(yáng)性而且對(duì)雌激素敏感，廣泛應(yīng)用于環(huán)境雌激素（例如雙酚類、類固醇類、多氯聯(lián)苯類、二噁英類等化合物）的檢測(cè)與評(píng)價(jià)。MCF-7細(xì)胞增殖試驗(yàn)是國(guó)外最常用的檢測(cè)環(huán)境雌激素的方法之一，具有靈敏度高、可同時(shí)檢測(cè)多種環(huán)境雌激素、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。因此，本研究選用經(jīng)典的模式細(xì)胞MCF-7對(duì)雙酚芴進(jìn)行體外研究，旨在闡明雙酚芴對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性效應(yīng)及毒性機(jī)制。分析了不同濃度雙酚芴對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）及細(xì)胞全基因組mRNA表達(dá)譜的影響；并通過對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集通路分析，將差異表達(dá)基因富集到相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路，探討雙酚芴對(duì)細(xì)胞的分子毒性機(jī)制，為進(jìn)一步驗(yàn)證雙酚芴對(duì)細(xì)胞的毒性機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技公司（BNCC）；雙酚芴、雌二醇（17-β-estradiol，E2）購(gòu)自Sigma公司；胰酶、青鏈霉素雙抗、碳吸附血清、DMEM高糖培養(yǎng)基均購(gòu)自中科邁晨（北京）科技有限公司；CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）及 TRIzol試劑購(gòu)自Promega公司；活性氧檢測(cè)試劑盒（DCFHDA探針）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人類4×44K基因表達(dá)微陣列v2芯片購(gòu)自Agilent公司；RNeasy Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

MCF-7細(xì)胞消化后按10 000/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，至約80%成片。棄掉培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗一次，加入含10%碳吸附血清的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基及不同濃度的雙酚芴進(jìn)行處理，分別設(shè)置10-5～10-12mol/L 的雙酚芴、陽(yáng)性對(duì)照 E2（10-9mol/L）以及不加藥陰性對(duì)照，每個(gè)濃度雙酚芴及對(duì)照均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入20 μL/孔CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒中的MTS試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育3 h，酶標(biāo)儀測(cè)定D490nm值，計(jì)算各組平均D值和細(xì)胞相對(duì)存活率。細(xì)胞相對(duì)存活率（%）=（D暴露組-D空白對(duì)照）/（D對(duì)照組-D空白對(duì)照）×100%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用t檢驗(yàn)，雙樣本等方差假設(shè)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.3 ROS檢測(cè)

MCF-7細(xì)胞消化后接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h至約80%成片。棄掉培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗一次，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及不同濃度的雙酚芴進(jìn)行處理，分別設(shè)置10-5～10-10mol/L的雙酚芴及不加藥陰性對(duì)照，每個(gè)濃度雙酚芴及對(duì)照均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌一次。采用ROS檢測(cè)試劑盒，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用t檢驗(yàn)，雙樣本等方差假設(shè)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 全基因組表達(dá)譜分析

1.4.1 BHPF細(xì)胞暴露及細(xì)胞收獲 MCF-7細(xì)胞消化后接種75 cm2細(xì)胞瓶，傳代后24 h（約80%成片）棄掉培養(yǎng)基，加入不同濃度的雙酚芴進(jìn)行處理，設(shè)置不加藥對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，加入10 mL/瓶TRIzol試劑，反復(fù)吹打幾次后收獲細(xì)胞，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 芯片雜交 收獲細(xì)胞，提取總RNA，用Nano Drop ND-1000定量RNA，標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳評(píng)估RNA的完整性。樣品標(biāo)記和芯片雜交根據(jù)Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實(shí)驗(yàn)方案（AgilentTechnology）執(zhí)行。每個(gè)樣品的總RNA被線性擴(kuò)增，使用Cy3-UTP 標(biāo)記；用 RNeasy Mini Kit（Qiagen）純化標(biāo)記的cRNAs，并用Nano Drop ND-1000檢測(cè)濃度和活性；用人類4×44K基因表達(dá)微陣列v2芯片雜交后進(jìn)行洗滌、固定并掃描。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 用Agilent Feature Extraction軟件（v11.0.1.1）獲得芯片圖并讀值，得到原始數(shù)據(jù)；用Gene Spring GXv12.1軟件（Agilent Technologies）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)處理；原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過篩選高質(zhì)量探針進(jìn)行進(jìn)一步分析。2組樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因通過散點(diǎn)圖篩選；2個(gè)樣品間差異表達(dá)基因通過Fold Change篩選；用R腳本進(jìn)行層次聚類；用標(biāo)準(zhǔn)的富集計(jì)算方法進(jìn)行Pathway分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

不同濃度（10-5～10-12mol/L）的BHPF作用于MCF-7細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞存活率的影響見圖1。10-5mol/L的BHPF作用于MCF-7細(xì)胞，與對(duì)照組相比可以顯著降低細(xì)胞的存活率（P=0.002）；E2陽(yáng)性對(duì)照組具有增殖效應(yīng)，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.023）；其他濃度組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 不同濃度的BHPF作用MCF-7細(xì)胞24 h后的細(xì)胞存活率

2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

不同濃度（10-5～10-10mol/L）的 BHPF作用于MCF-7細(xì)胞24 h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果如圖 2。與對(duì)照組相比，10-5、10-6mol/L BHPF 組ROS 水平顯著降低；10-7、10-8、10-9、10-10mol/L BHPF組ROS水平均顯著升高。

圖2 不同濃度的BHPF作用于MCF-7細(xì)胞24 h后細(xì)胞ROS水平

2.3 BHPF引起MCF-7細(xì)胞全基因組mRNA表達(dá)譜改變

2.3.1 差異表達(dá)mRNA分析 總計(jì)檢測(cè)到30 908條mRNA，用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異mRNAs篩選，以差異倍數(shù)≥2.0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，各濃度篩選出表達(dá)上調(diào)、下調(diào)及無(wú)明顯差異的mRNA數(shù)詳見圖3。利用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異倍數(shù)＞2為橫縱坐標(biāo)的設(shè)定值，給出差異表達(dá)mRNA的散點(diǎn)圖（圖3）。

圖3 BHPF各濃度組與對(duì)照組相比差異表達(dá)mRNA散點(diǎn)圖

2.3.2 差異表達(dá)mRNA聚類分析 一般來說，同一類樣品能通過聚類出現(xiàn)在同一個(gè)簇中，聚在同一個(gè)簇的樣品可能具有相似的生物學(xué)性質(zhì)。本研究所展示的聚類圖的上方分枝結(jié)構(gòu)代表樣本的聚類情況，聚類圖下方代表樣本的分組信息，中間的每一個(gè)條形代表檢測(cè)到的mRNA，其中紅色代表相對(duì)高的表達(dá)量，綠色代表相對(duì)低的表達(dá)量。根據(jù)芯片檢測(cè)到的mRNA數(shù)及差異表達(dá)的mRNA數(shù)，分別做出對(duì)應(yīng)的聚類圖，詳見圖4。

圖4 BHPF各濃度組與對(duì)照組相比差異表達(dá)mRNA聚類分析圖

2.3.3 差異表達(dá)mRNA KEGG Pathway分析 根據(jù)分子參與的功能，KEGG Pathway以Pathway Map形式展示每個(gè)通路中基因（蛋白質(zhì)）、小分子等網(wǎng)絡(luò)，對(duì)上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行綜合分析以推斷它們參與的通路。差異表達(dá)的mRNA通過FISH精確檢驗(yàn)的計(jì)算方法，以P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示 10-5、10-7、10-9、10-10mol/L 雙酚芴組分別富集到78、7、32、17條通路。挑選P值最小的前10個(gè)顯著富集的條目進(jìn)行圖形化展示，若不足10個(gè)，則全部展示（圖5）。

圖5 BHPF各濃度組與對(duì)照組差異表達(dá)mRNA參與的細(xì)胞信號(hào)通路

3 討論

傳統(tǒng)毒理學(xué)研究認(rèn)為，污染物達(dá)到一定暴露劑量即可對(duì)生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng)，而低于安全閾值則不具有相應(yīng)的毒性。MCF-7細(xì)胞增殖方法可以設(shè)定化合物的不同濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行暴露，被測(cè)物質(zhì)的濃度可以低至10-11mol/L級(jí)水平就可能有明顯的生物效應(yīng)，是一種比較靈敏且經(jīng)濟(jì)的生物評(píng)價(jià)方法，而且重現(xiàn)性好。本研究中，BHPF暴露MCF-7細(xì)胞24 h后顯示高濃度10-5mol/L可以顯著降低細(xì)胞存活率，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其他濃度組與對(duì)照組相比雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)都顯示10-6mol/L組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也具有一定的抑制作用。該實(shí)驗(yàn)表明高于10-6mol/L濃度的BHPF對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，低于10-6mol/L濃度的BHPF對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

真核細(xì)胞在有氧呼吸過程中，有少量氧不能被完全還原，從而生成了具有較強(qiáng)氧化作用的ROS，包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（HO）及過氧化氫（H2O2）等。正常生命過程中，適量的ROS具有一定的免疫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，是機(jī)體的有效防御系統(tǒng)[18]。但過多的ROS則會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成損害。大量研究表明內(nèi)源性雌激素或外源雌激素活性物質(zhì)暴露可誘導(dǎo)ROS生成，并最終調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖/凋亡過程[19-20]。本研究中，10-7、10-8、10-9及 10-10mol/L BHPF 作用于細(xì)胞后ROS水平均顯著升高，10-5及10-6mol/L組ROS水平顯著降低。由于10-5及10-6mol/L組的細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，ROS水平降低也可能是受到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞數(shù)量的影響。

用不同濃度的雙酚芴作用于MCF-7細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)各濃度的雙酚芴均能引起細(xì)胞全基因組mRNA表達(dá)譜發(fā)生改變，10-5、10-9、10-10mol/L濃度組差異變化較大，10-7mol/L組差異變化較小。對(duì)差異表達(dá)的上調(diào)、下調(diào)mRNA進(jìn)行KEGG Pathway聚類分析，可以將差異基因富集到相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路，雙酚芴作用于MCF-7細(xì)胞可能通過這些細(xì)胞信號(hào)通路參與對(duì)細(xì)胞的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)及毒性效應(yīng)。根據(jù)初步分析結(jié)果，后續(xù)研究將重點(diǎn)針對(duì)NOD受體信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、自噬、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路以及磷脂酰肌醇-3-羥激酶等信號(hào)通路上的相關(guān)基因及蛋白做進(jìn)一步驗(yàn)證，為雙酚芴對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。