李嘉辰，俞斌，王琦，張麗

（1 浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州310029； 2 浙江理工大學(xué)理學(xué)院，浙江杭州310018）

引 言

納米管材料由于具有空腔管體結(jié)構(gòu)、能跨越生物體的多重屏障等特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于藥物輸運(yùn)的研究[1-4]。相比于碳納米管（CNTs），氮化硼納米管(BNNTs)由于具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的生物相容性，在藥物輸運(yùn)領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注[3-6]。例如，Li 等[5]報(bào)道由BNNTs 構(gòu)建的薄膜可以改善人類原代乳腺成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的乳腺細(xì)胞系的增殖。Chen 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，BNNTs 能作為載體將寡聚DNA輸運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部并且沒有發(fā)現(xiàn)BNNTs 具有明顯細(xì)胞毒性?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明BNNTs 在藥物輸運(yùn)系統(tǒng)中存在潛在應(yīng)用前景。

然而由于BNNTs 具有較大比表面積和較高化學(xué)穩(wěn)定性，BNNTs 常通過π-π 堆積的方式聚集且難于分散，限制了其應(yīng)用[7]。有效提高BNNTs的分散性對(duì)于將BNNTs 應(yīng)用于藥物輸運(yùn)領(lǐng)域具有重要意義。由于殼聚糖及其衍生物在低pH 溶液中顯示出生物降解性、細(xì)胞膜黏附性和易質(zhì)子化等優(yōu)點(diǎn)[8-11]，通過引入殼聚糖及其衍生物可以進(jìn)一步提高BNNTs 的分散性和生物相容性[11]。此外由于生物系統(tǒng)中的pH 水平不同（例如，癌細(xì)胞周圍pH 較低[12-13]），質(zhì)子化殼聚糖還能夠與某些腫瘤細(xì)胞表面的多糖受體結(jié)合，提高載體的有效靶向性[14]。殼聚糖及其衍生物可作為pH 敏感載體將藥物分子遞送到靶細(xì)胞中[15-17]。因此，殼聚糖-BNNTs 復(fù)合載體在藥物輸運(yùn)領(lǐng)域存在潛在的應(yīng)用前景。

近年來，分子動(dòng)力學(xué)模擬（MD）的方法可以在原子及分子水平提供許多現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)還無法觀測(cè)的信息，從而為解釋藥物靶向輸運(yùn)機(jī)制和載體材料分子設(shè)計(jì)提供依據(jù)[18-20]。本課題組在之前利用MD 研究結(jié)果表明，殼聚糖與BNNTs 的作用方式受到殼聚糖骨架上官能團(tuán)以及BNNTs 管徑大小的影響。非質(zhì)子化殼聚糖可以通過BNNTs 管徑調(diào)節(jié)快速自發(fā)地進(jìn)入BNNTs 管中，而質(zhì)子化殼聚糖由于周圍有序水化層，會(huì)影響進(jìn)入管中的動(dòng)力學(xué)過程[20]。這為利用殼聚糖封裝藥物進(jìn)入BNNTs 提供理論依據(jù)。本文主要通過MD 方法，以抗癌藥物阿霉素DOX 為藥物模型，揭示利用殼聚糖-BNNTs 復(fù)合載體材料封裝及輸運(yùn)抗癌藥物的可行性。該研究將為基于BNNTs 的藥物載體材料的設(shè)計(jì)與應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

1 模擬方法

1.1 模型及力場(chǎng)構(gòu)建

如圖1所示，通過替換多糖上的—OH，構(gòu)建2種10 聚的殼聚糖模型：完全脫乙?；臍ぞ厶牵ā狽H2chitosan,CS_A10）以及完全脫乙?；屹|(zhì)子化的殼聚糖(—NH3+chitosan, CS_B10)。功能化基團(tuán)參數(shù)包括非鍵參數(shù)及殼聚糖單元之間的成鍵參數(shù)，鍵連、角度、二面角等參數(shù)來自Ferreira 等[21]的工作。非鍵參數(shù)通過Gaussian03 軟件[22]，采用HF/6-31G+的方法，分別優(yōu)化2 種含不同官能團(tuán)（—NH2和—NH3+）殼聚糖單體結(jié)構(gòu)得到。

圖1 10聚殼聚糖模型，由替換多糖—OH獲得（所有原子以licorice模型顯示）Fig.1 Initial structure of chitosan with 10 units was generated by replacing glucose unit—OH group into—NH2 and—NH3+groups,respectively

阿霉素(doxorubicin,DOX)是一種常用廣譜抗癌藥物。本文以DOX 為藥物模型，揭示利用殼聚糖-BNNTs 輸運(yùn)抗癌藥物的可行性。DOX 電荷通過Gaussian03軟件[22]，采用HF/6-31G+的方法獲得。

結(jié)合本課題組之前殼聚糖BNNTS 復(fù)合材料的研究，本工作探討利用BNNT (14,14)封裝殼聚糖和DOX 的可行性。如圖1(c)所示，BNNT(14,14)模型通過VMD 軟件nanotube-build 模塊構(gòu)建[23]。BNNT(14,14) 使 用AMBER-GAFF 力 場(chǎng)，其 中BNNT (14,14) 電荷以及LJ 作用參數(shù)來自Aluru 等[24]的工作。BNNT(14,14)中硼和氮原子電荷參數(shù)分別為+0.300和-0.300；LJ 參數(shù)包括sigma (nm)和epsilon (kJ/mol)分 別 為 硼 原 子：0.337 和0.602；氮 原 子：0.345 和0.393。

棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,POPC)常用于模擬細(xì)胞膜磷脂雙分子層。磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)文件以及AMBER-GAFF 力場(chǎng)形式POPC 的力場(chǎng)文件由lipidbook 網(wǎng)站下載。磷脂雙分子層由上下2×256個(gè)POPC組成。

1.2 模擬細(xì)節(jié)

1.2.1 殼聚糖-BNNTs 封裝DOX 殼聚糖-BNNTs封裝DOX的模擬初始構(gòu)型截圖如圖2(a)所示。首先獲得了CS_A10/DOX 的構(gòu)型。然后將CS_A10/DOX 的構(gòu)型放置在BNNT(14,14)管口，進(jìn)行殼聚糖-BNNTs封裝DOX 的模擬。模擬系統(tǒng)置于9 nm × 9 nm× 17 nm 的水盒子當(dāng)中，水分子采用TIP3P 模型。模擬過程采用周期性邊界條件，模擬步長(zhǎng)為2 fs。采用PME的方法[25]計(jì)算靜電作用并且范德華作用截?cái)喟霃綖?.2 nm。通過Lorentz-Berthelot 的方法[26]計(jì)算不同原子之間的LJ 作用勢(shì)。模擬中通過velocity rescaling 方法[27]控制溫度為300 K，并且將BNNTs 固定住。模擬系統(tǒng)先進(jìn)行5000 步的能量?jī)?yōu)化然后進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的NVT模擬。

圖2 殼聚糖-BNNTs封裝(a)及跨膜輸運(yùn)(b)DOX的初始構(gòu)型截圖（CS_B10殼聚糖為licorice模型，POPC為line模型，BNNT為licorice模型，DOX為vdW模型；截圖中沒有顯示水分子和反離子）Fig.2 Initial structure of encapsulation(a)and transmembrane transport(b)of DOX by chitosan-BNNT(14,14)

1.2.2 殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運(yùn)DOX 人體腫瘤細(xì)胞環(huán)境pH 較低，殼聚糖在低pH 條件下易質(zhì)子化。Thomas 等[28]報(bào)道BNNTs 能自發(fā)嵌入并穩(wěn)定存在于磷脂雙分子層中。為研究癌細(xì)胞環(huán)境利用殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運(yùn)DOX，如圖2(b) 所示，將得到的穩(wěn)定CS_A10/DOX/BNNT 構(gòu)型替換為完全質(zhì)子化狀態(tài)的CS_B10/DOX/BNNT 構(gòu)型，并且將CS_B10/DOX/BNNT 的構(gòu)型部分嵌入到磷脂雙分子層之中。殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運(yùn)DOX 時(shí)，模擬盒子大小為10 nm×10 nm×12 nm。

1.2.3 平均力勢(shì)（potential mean of force，PMF）自由能計(jì)算 通過umbrella sampling 方法[29]計(jì)算一個(gè)單元—NH2殼聚糖與BNNT (14,14)以及DOX 與BNNT(14,14)之間的PMF。PMF 計(jì)算時(shí)，施加距離限制。以BNNT (14,14)為中心，反應(yīng)路徑為—NH2殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)之間的質(zhì)心距離。質(zhì)心距離限制時(shí)，簡(jiǎn)諧勢(shì)力常數(shù)為3000 kJ/(mol· nm2)。采樣窗口間隔距離為0.05 nm，一條完整PMF 曲線采樣共計(jì)60 個(gè)窗口。其中，每個(gè)窗口進(jìn)行10 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬，取數(shù)據(jù)后5 ns 用于PMF 分析。PMF 分析時(shí)，采用WHAM 方法[30]去除額外施加的諧振勢(shì)的影響。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖-BNNTs封裝DOX

BNNTs 由于具有空腔管體結(jié)構(gòu)，能跨越生物體的多重屏障等特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于藥物輸運(yùn)的研究領(lǐng)域[3-4,6]。利用BNNTs 空腔管體結(jié)構(gòu)，將抗癌藥物封裝到BNNTs 管道中可以提高抗癌藥物利用率并有效降低其毒副作用。模擬進(jìn)行前將CS_A10/DOX 的構(gòu)型放置在BNNT(14,14)管口，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬探討殼聚糖-BNNTs 封裝DOX 的可行性。如圖3所示，30 ns瞬時(shí)構(gòu)型圖中可以看出，CS_A10殼聚糖與DOX能完全進(jìn)入管中。圖3中統(tǒng)計(jì)CS_A10殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)質(zhì)心距離隨時(shí)間的變化?？梢钥闯?，模擬5 ns 內(nèi)殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)之間的距離迅速下降，最后在0 左右波動(dòng)。結(jié)果表明，殼聚糖-BNNTs 復(fù)合載體能夠迅速封裝DOX，存在潛在的應(yīng)用前景。

如圖4 所示，計(jì)算一個(gè)單元—NH2殼聚糖與BNNT (14,14)以及DOX 與BNNT (14,14)之間的PMF，進(jìn)一步研究DOX 封裝過程?！狽H2殼聚糖以及DOX 從管口2 nm 到管中心0 nm 時(shí),進(jìn)入管中的自由能逐漸降低。也可以發(fā)現(xiàn)，一個(gè)單元—NH2殼聚糖以及DOX 穿過管中心的自由能分別為-11 和-56 kJ/mol。自由能結(jié)果表明，殼聚糖以及DOX 存在進(jìn)入管中的趨勢(shì)。更多單元的殼聚糖進(jìn)一步提供進(jìn)入管中的驅(qū)動(dòng)力。然而本課題組最近研究發(fā)現(xiàn)[20]，質(zhì)子化殼聚糖需要很長(zhǎng)時(shí)間才能進(jìn)入管中。盡管自由能有利于質(zhì)子化殼聚糖進(jìn)入管中，但BNNT 管中[圖5(a) Ⅰ所示]以及質(zhì)子化殼聚糖周圍存在的有序分布水化層，會(huì)影響殼聚糖進(jìn)入的動(dòng)力學(xué)過程以及封裝效率。DOX 尺寸較大，類似質(zhì)子化殼聚糖也會(huì)影響進(jìn)入動(dòng)力學(xué)過程。為此，如圖5 所示，通過牽引不同固定取向DOX 進(jìn)入管中，進(jìn)一步分析所施加外力隨時(shí)間的變化?？梢园l(fā)現(xiàn)當(dāng)DOX共軛環(huán)相對(duì)xy面水平（horizontal）進(jìn)入管口后，牽引力出現(xiàn)明顯峰值且遠(yuǎn)大于以豎直（vertical）方式進(jìn)入管中。表明DOX 需要調(diào)整構(gòu)象才能進(jìn)入管中。圖3(b)中也顯示，殼聚糖攜帶DOX 進(jìn)入管中時(shí)，能夠吸附固定且調(diào)整DOX 以合適的角度進(jìn)入管中。因此，殼聚糖攜帶DOX 進(jìn)入管中時(shí)，殼聚糖存在特殊優(yōu)勢(shì)：一方面能提供進(jìn)入驅(qū)動(dòng)力，另一方面能調(diào)整DOX以合適構(gòu)象進(jìn)入管中。

圖3 (a)CS_A10殼聚糖/DOX與BNNT(14,14)質(zhì)心距離隨時(shí)間的變化；(b)體系初始以及30 ns 瞬時(shí)構(gòu)型圖Fig.3 (a)Center of mass(COM)distance between CS_A10/DOX and BNNT(14,14)versus simulation time;(b)snapshot of system at 0 and 30 ns

圖4 一個(gè)單元—NH2殼聚糖與BNNT(14,14)以及DOX與BNNT(14,14)之間的PMF（坐標(biāo)0為管中心位置，虛線為管口位置）Fig.4 Potential of mean force(PMF)of—NH2 and DOX passing through BNNT(14,14)[The reaction coordinate is along the central axis of BNNTs.0 nm is the middle location of the tube and the dotted lines represent the end location of BNNT(14,14)]

圖5 (a)Ⅰ:BNNT(14,14)管中水的xy平面密度分布圖；不同取向DOX的初始構(gòu)型，Ⅱ:DOX共軛環(huán)相對(duì)xy面豎直（vertical）放置；Ⅲ:水平（horizontal）放置；(b)牽引不同取向DOX進(jìn)入管中所施加外力隨時(shí)間的變化（牽引速率為0.01 nm/ps，虛線表示管口位置）Fig.5 (a)Ⅰ:Density map of water molecules in BNNT(14,14)in xy plane;DOX with different orientations in xy plane,Ⅱ:vertical;Ⅲ:horizontal;(b)external force on DOX versus simulation time[the pull rate is 0.01 nm/ps and the dotted lines represent the end location of BNNT(14,14)]

2.2 殼聚糖-BNNTs跨膜輸運(yùn)DOX

為實(shí)現(xiàn)殼聚糖-BNNTs 復(fù)合載體在藥物輸運(yùn)領(lǐng)域的應(yīng)用，從分子水平理解殼聚糖-BNNTs 復(fù)合載體材料與生物體及藥物之間相互作用具有重要的意義，而細(xì)胞膜是生物體中藥物輸運(yùn)過程的重要屏障?；诖吮疚奶接懥藲ぞ厶?BNNTs 復(fù)合載體跨膜輸運(yùn)DOX 過程的可行性。跨膜輸運(yùn)DOX 時(shí)，考慮到腫瘤低pH 環(huán)境，選擇將CS_A10/DOX/BNNT 構(gòu)型，替換為完全質(zhì)子化狀態(tài)的CS_B10/DOX/BNNT構(gòu)型。

從圖6 所示的瞬時(shí)構(gòu)型圖可以發(fā)現(xiàn)BNNT (14,14)管隨模擬時(shí)間增長(zhǎng)不斷陷入并最終完全進(jìn)入到磷脂雙分子層（POPC）中。圖7(a)為POPC/CS_B10殼聚糖/DOX 與BNNT(14,14)質(zhì)心距離隨時(shí)間的變化。BNNT (14,14)管與POPC 的距離最初為2.5 nm。隨著模擬時(shí)間的不斷增長(zhǎng)，BNNT(14,14)管與POPC 的距離不斷下降，10 ns 后下降到并最終穩(wěn)定在0 nm左右。即BNNTs 能穩(wěn)定存在于POPC 中，該結(jié)果與Thomas 等[28]研究結(jié)果較好吻合，他們指出BNNTs 能自發(fā)嵌入并穩(wěn)定存在于磷脂雙分子層中。此外從圖6 所示的瞬時(shí)構(gòu)型圖中不難發(fā)現(xiàn)，隨著模擬時(shí)間的不斷增長(zhǎng)，CS_B10殼聚糖從管中逐漸脫離并最終穩(wěn)定吸附于POPC 表面。DOX 也由BNNT (14,14)管底部最終上升到管頂部。圖7(a)也顯示CS_B10殼聚糖/DOX與BNNT(14,14)管中心的距離快速上升。

圖6 殼聚糖-BNNTs復(fù)合載體跨細(xì)胞膜輸運(yùn)DOX的瞬時(shí)構(gòu)型圖Fig.6 Snapshot of transmembrane transport of DOX by chitosan-BNNT(14,14)

圖7 (a)POPC/CS_B10殼聚糖/DOX與BNNT(14,14)質(zhì)心距離隨時(shí)間的變化；(b)CS_B10殼聚糖/DOX/PO與BNNT(14,14)相互作用能隨時(shí)間的變化（PO表示單個(gè)進(jìn)入管中的POPC分子）；(c)BNNT(14,14)管中隨時(shí)間的模擬細(xì)節(jié)截圖（虛線為POPC的中心位置）Fig.7 (a)COM distance between POPC/CS_B10/DOX and BNNT(14,14)versus simulation time;(b)interaction energy between CS_B10/DOX/PO and BNNT(14,14);(c)snapshot in BNNT(14,14)(the dotted line is the center of POPC)

圖7(c) 為BNNT (14,14)管中過程細(xì)節(jié)圖，隨著BNNT(14,14)管不斷陷入POPC 中，2 ns 左右管中進(jìn)入一個(gè)完整的磷脂分子。而隨著磷脂分子的進(jìn)入，由于管中空間有限，CS_B10殼聚糖以及DOX 被不斷向上排擠。為驗(yàn)證這一結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)CS_B10殼聚糖、DOX 以及PO（進(jìn)入管中的磷脂分子）與BNNT(14,14)相互作用能隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖7(b) 所示。從圖中可知PO與BNNT(14,14)相互作用最強(qiáng)，即磷脂分子能穩(wěn)定存在于BNNT(14,14)管中。此外POPC 與BNNT (14,14)的較強(qiáng)疏水作用使得BNNT(14,14)不斷陷入POPC中，管中磷脂分子因而能不斷向上逐漸排擠CS_B10殼聚糖以及DOX。而隨著CS_B10殼聚糖不斷被擠出管中，CS_B10殼聚糖與BNNT(14,14)相互作用逐漸減弱為0，CS_B10殼聚糖完全脫離BNNT (14,14)管，DOX 上升到BNNT (14,14)上方。該結(jié)果表明，殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運(yùn)阿霉素時(shí)，管中吸附物質(zhì)能被細(xì)胞膜磷脂分子擠出或者存在離開管中趨勢(shì)。這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供思路：即可以提高管中封裝藥物濃度，當(dāng)跨膜輸運(yùn)時(shí)，藥物可以被磷脂分子擠出，進(jìn)一步提高腫瘤部位給藥濃度。

3 結(jié) 論

本文采用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，對(duì)殼聚糖-BNNTs復(fù)合載體封裝以及跨膜輸運(yùn)DOX 進(jìn)行研究，得到以下結(jié)論。

（1）PMF 自由能顯示DOX 以及非質(zhì)子化殼聚糖存在自發(fā)進(jìn)入管中趨勢(shì)，通過施加力變化分析發(fā)現(xiàn)DOX 以不同構(gòu)象進(jìn)入管中難易程度不同。結(jié)果表明，非質(zhì)子化殼聚糖能提供DOX 進(jìn)入管中驅(qū)動(dòng)力，并吸附且調(diào)整DOX 以合適的構(gòu)象進(jìn)入管中。

（2）殼聚糖-BNNTs 跨膜輸運(yùn)阿霉素時(shí)，相互作用能結(jié)果顯示，細(xì)胞膜磷脂分子與BNNT (14,14)管存在較強(qiáng)的相互作用，磷脂分子能自發(fā)嵌入到BNNT (14,14)管中。管中吸附物質(zhì)能被細(xì)胞膜磷脂分子擠出。這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供思路，即可以提高管中封裝藥物濃度，當(dāng)跨膜輸運(yùn)時(shí)，通過磷脂分子擠出藥物來進(jìn)一步提高腫瘤部位給藥濃度。