鄭博，廖湘凌，丁南，王敬國，龐曉霞

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院 口腔科，北京 101100）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是人頭頸部惡性腫瘤中常見的病理類型之一，占世界癌癥死亡率的第6 位[1]。鈣激活中性蛋白酶2（calcium activated neutral protease 2, Calpain-2）是鈣依 賴性半胱氨酸蛋白水解酶家族成員，廣泛表達(dá)在哺乳動(dòng)物中。研究表明，Calpain-2 高表達(dá)與基底樣或三陰性乳腺癌的不良結(jié)果相關(guān)[2]。同時(shí)，Calpain-2 高表達(dá) 也與卵巢癌患者的鉑耐藥性和較差的總體存活率相關(guān)[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，組織中的鈣激活中性蛋白酶對某些腫瘤細(xì)胞的遷移能力有明顯影響[4]。本研究檢測OSCC 患者癌組織與癌旁組織中Calpain-2 的表達(dá)量，并進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)分析OSCC 組織Calpain-2 的表達(dá)及對5年生存率的影響。同時(shí)，利用shRNA 技術(shù)構(gòu)建OSCC 低表達(dá)Calpain-2 的細(xì)胞系，研究Calpain-2 對OSCC 腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 資料與方法

1.1 組織及細(xì)胞樣本

選取2011年3月—2014年3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院口腔科進(jìn)行外科手術(shù)并確診為OSCC患者的癌組織74 例，取距離癌組織≥5 cm 的癌旁組織作為對照組。HSC3、HSC6 細(xì)胞購自日本生物研究資源細(xì)胞庫。OSCC 細(xì)胞為貼壁生長，用DMEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清，放置在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)及評分標(biāo)準(zhǔn) 將OSCC 組織及癌旁組織用4%多聚甲醛固定48 h，按試劑盒說明書操作，以不加一抗為對照，受試樣一抗為Calpain-2 單克隆抗體[美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。免疫染色陽性物質(zhì)均呈棕黃色顆粒，2 人雙盲法觀察切片。染色分值由2個(gè)指標(biāo)衡量：一是陽性細(xì)胞率，每例隨機(jī)選擇8個(gè)高倍鏡視野，取平均值共計(jì)800個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例計(jì)算陽性表達(dá)率：1 分，1%～33%；2 分，34%～67%；3 分，68%～100%。二是染色強(qiáng)度，1 分，弱表達(dá)；2 分，中表達(dá)；3 分，強(qiáng)表達(dá)。染色分值=陽性細(xì)胞率×染色強(qiáng)度，分值為0～9 分，＜6 分為低表達(dá)，≥6 分為高表達(dá)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 使用RNAiso Reagent（日本TaKaRa 公司）試劑盒提取總RNA，用Oligo primer 和Go Script ? Reverse Transcription System（美國Roche 公司），取1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后RT-PCR（Light Cycler 480,美國Roche 公司）用雙鏈DNA 特異SYBR Green I Dye 檢測Calpain-2 的表達(dá)。具體反應(yīng)體系參照試劑盒說明書，總體系20 ml，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。Calpain-2 正向引物：5'-GCTGCCGTTTG CTGAGTGTC-3'；反向引物：5'-CGGTCACAGAGTAGG CATGG-3'。長度120 kb。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （GAPDH）為內(nèi)參，GAPDH 正向引物：5'-AACTTTGGC ATTGTGGAAGG-3'；反向引物：5'-ACACATTGGGGG TAGGAACA-3'。長度310 kb。

1.2.3 Western blotting 用RIPA 裂解液裂解OSCC樣本或細(xì)胞系，加入5×上樣緩沖液95℃ 3 min，提取總蛋白，10% SDS-PAGE 電泳，分離蛋白樣本，以抗人Calpain-2（美國Abcam 公司）單克隆抗體4℃孵育過夜。過氧化物酶連接的抗小鼠二抗（CST）常溫孵育2 h 后，以HRP 化學(xué)發(fā)光液（美國Mllipore 公司）觀察蛋白表達(dá)量。

1.2.4 shRNA 轉(zhuǎn)染 OSCC 細(xì)胞系以2×105個(gè)/孔接種到6 孔板中。待細(xì)胞貼壁后用凝聚銨溶液每孔轉(zhuǎn)染5 mg Calpain 2-shRNA 載體或?qū)φ蛰d體。轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞消化下來重新鋪到15 cm 培養(yǎng)皿中，加入0.5 mg/ml 嘌呤霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。2 周后，分離出單個(gè)克隆并接種到96 孔板中進(jìn)一步篩選。2個(gè)月后可以篩選出具嘌呤霉素抗性的穩(wěn)轉(zhuǎn)系，繼續(xù)在含1 mg/ml 嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) Calpain-2 shRNA 轉(zhuǎn)染后的OSCC 細(xì)胞系以5×103個(gè)/ml 接種到96 孔板中，培養(yǎng)24、48、72 和96 h 后，用Cell Counting Kit-8（CCK-8，美國Sigma 公司）檢測細(xì)胞生長情況。每孔加入10 μl CCK-8 37℃孵育3～4 h 后，用450 nm 處的光密度（OD）值減去減去650 nm 處的背景進(jìn)行測量染色。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞重懸在無血清DMEM培養(yǎng)基中，按1.5×105個(gè)/孔將用Cell Trace 標(biāo)記的細(xì)胞 鋪在Transwell 小室的上層，下層放置500 ml 含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放置在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h 后將細(xì)胞固定，熒光顯微鏡下400 放大倍數(shù)計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)5個(gè)視野，取均值。

1.2.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) OSCC 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 48 h 后，用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit（美國BD 公司）檢測細(xì)胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析用 Kaplan-Meier 法，采用Log-rankχ2檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC 組織及癌旁組織Calpain-2 的表達(dá)

Calpain-2 在OSCC 組織中的表達(dá)較癌旁組織高（χ2=99.925，P=0.000）。74 例早期OSCC 患者中，57 例（77.03%）Calpain-2表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，其中，38例為高表達(dá)，19 例為低表達(dá)；56 例（75.68%）Calpain-2 表達(dá)于細(xì)胞膜，其中，30 例陰性，26 例陽性；30 例于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜共同表達(dá)。見圖1。

2.2 OSCC 組織及癌旁組織的Calpain-2 mRNA和Calpain-2 蛋白表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，OSCC組織的Calpain-2 mRNA相對表達(dá)水平為（4.81±0.14），癌旁組織為（1.15± 0.08），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=195.259，P= 0.001），OSCC 組織的Calpain-2 mRNA 水平較癌旁組織上調(diào)。Western blotting 顯示OSCC 組織的Calpain-2表達(dá)高于癌旁組織。見圖2。

圖1 OSCC 組織及癌旁組織Calpain-2 表達(dá) （免疫組織化學(xué) ×200）

圖2 OSCC 組織與癌旁組織的Calpain-2 的 表達(dá)情況比較

2.3 Calpain-2 表達(dá)與總體生存率的關(guān)系

74 例患者5年死亡33 例（44.59%），存活41 例（55.41%）。Calpain-2 在細(xì)胞膜中陰性與陽性5年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

2.4 轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細(xì)胞系中Calpain-2 的表達(dá)

與對照組比較，Calpain-2 敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細(xì)胞系中Calpain-2 表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖3。

表1 Calpain-2 表達(dá)與OSCC 患者5年生存率的關(guān)系

2.5 轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細(xì)胞系細(xì)胞的生長情況

轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 后，OSCC 細(xì)胞系（HSC3）在100 h 的OD 值為（3.1±1.0），與轉(zhuǎn)染陰性對照細(xì)胞 的Control shRNA OD 值（2.8±0.9）比較，差異無統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（t=1.918，P=0.060）。見圖4。

2.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)Calpain-2 shRNA 的OSCC 細(xì)胞系細(xì)胞 的凋亡情況

以Calpain-2 shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)的OSCC 細(xì)胞系（HSC6）凋亡率為（9.83±1.57）%，與對照細(xì)胞系的凋亡率 （10.13±0.94）% 及其Annexin V單陽性細(xì)胞和Annexin V/PI 雙陽性細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 1.410，P=0.163）。見圖5。

2.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)Calpain-2 shRNA 的OSCC 細(xì)胞系細(xì)胞 的遷移情況

低表達(dá)Calpain-2 的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細(xì)胞系遷移率（58.1±2.98）%與對照細(xì)胞系（15.56±6.07）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖6）。在接種至培養(yǎng)皿48 h 后，遷移的細(xì)胞數(shù)量降低63.3%。

圖3 Calpain-2 敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細(xì)胞系中 Calpain-2 的表達(dá)

圖4 轉(zhuǎn)染Calpain-2 shRNA 的OSCC 細(xì)胞系的生長情況

圖5 Calpain-2 敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)OSCC 細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡情況

圖6 以Calpain-2 shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)的OSCC 細(xì)胞系細(xì)胞的遷移情況

3 討論

近年來，關(guān)于Calpain 介導(dǎo)的蛋白水解與Calpain參與化學(xué)性和興奮毒性神經(jīng)元?jiǎng)?chuàng)傷中神經(jīng)元壞死的研究受到極大的關(guān)注[5]。在靜息狀態(tài)下，Calpain-1 和Calpain-2 以異質(zhì)二聚體酶原（80+29）kD 的形式廣泛存在于各種細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞中Ca2+的含量發(fā)生異常馬上可以激活Calpain-2 和Calpain-2 發(fā)生自溶，形成異質(zhì)二聚體的活化形式[6]。在生理狀態(tài)下，Calpain-2的活性受內(nèi)源性的蛋白酶抑制蛋白調(diào)控[7]。在極端的情況下，Calpain-2 會被過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量持續(xù)處于高水平[8]。Calpain 反應(yīng)底物包括細(xì)胞支架蛋白、漿膜-細(xì)胞膜相關(guān)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)少量Calpain 被活化時(shí)，上述底物蛋白被水解后，可能會轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號或觸發(fā)細(xì)胞功能，如膜融合或細(xì)胞伸展[9]。

本研究分析多個(gè)OSCC 組織中Calpain-2 的含量，OSCC 組織中Calpain-2 表達(dá)比癌旁組織要高。Calpain-2 可能參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。Calpain-2 的高表達(dá)并不是影響OSCC 患者總體生存率的獨(dú)立因素，說明Calpain-2 并非直接影響腫瘤的發(fā)展，而是通過調(diào)控其他因素促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。為進(jìn)一步研究Calpain-2在腫瘤細(xì)胞中的作用，利用Calpain-2 shRNA 構(gòu)建低表達(dá)Calpain-2 的OSCC 穩(wěn)轉(zhuǎn)系，發(fā)現(xiàn)Calpain-2 敲低的OSCC 細(xì)胞的生長情況與對照組比較無差異，同時(shí)凋亡率與對照組也無差異。同時(shí)，通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，降低Calpain-2 的表達(dá)能抑制細(xì)胞的遷移。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測，OSCC 癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量異常，激活Calpain-2 發(fā)生自溶形成活化狀態(tài)與胞內(nèi)底物蛋白發(fā)生反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號或使腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移。已有文獻(xiàn)報(bào)道Calpain-2 與纖維肉瘤細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等癌細(xì)胞的遷移有關(guān)[10]。本研究表明，Calpain-2 可能也參與到OSCC 癌細(xì)胞的遷移過程中，有可能成為抑制OSCC 癌細(xì)胞遷移的重要靶點(diǎn)。