李正杰，張彥芬，柏艷柳，安麗娜，張永鋒

（1.河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035；2.承德燕峰藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050091）

決明子配方顆粒是由決明子藥材加工成飲片后經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒等制備而成，具有清熱明目，潤(rùn)腸通便的功效。臨床上常用于目赤澀痛，羞明多淚，頭痛眩暈，目暗不明，大便秘結(jié)[1]。決明子主要有效成分為蒽醌類化合物，有降血脂、降血壓、抑菌、瀉下，潤(rùn)腸通便、抗誘變等作用[2-4]，主要以游離蒽醌和蒽醌苷衍生物形式存在。目前文獻(xiàn)報(bào)道的蒽醌類含量測(cè)定主要是對(duì)大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素等的研究，采用的流動(dòng)相多為乙腈、0.1 %磷酸溶液梯度洗脫的方法測(cè)定[5-8]，本研究首次采用乙腈、甲醇、0.1 %磷酸溶液，等度洗脫法同時(shí)檢測(cè)決明子配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚的含量，相較于《中國(guó)藥典》決明子項(xiàng)下流動(dòng)相，降低了檢測(cè)方法對(duì)泵的要求，更有利于企業(yè)對(duì)決明子配方顆粒制劑中橙黃決明素、大黃酚的含量測(cè)定，降低檢測(cè)成本。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10AT高效液相色譜儀，配備SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-solution色譜工作站（日本島津公司）；AT201電子分析天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試藥

決明子配方顆粒（批號(hào)：161001，161002，161003）；橙黃決明素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111900-201202）；大黃酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)1110796-201319）；乙腈、甲醇為色譜純（Merck）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil100-5-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1 %磷酸（49:7:44）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：222 nm；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃；理論板數(shù)按橙黃決明素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取橙黃決明素和大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加90 %甲醇制成每1 ml中含橙黃決明素8 μg、大黃酚4 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約0.2 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（20:1）混合溶液25 ml，稱定重量，80 ℃水浴加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液3 ml，置入10 ml 量瓶，加2 %氫氧化鈉溶液1.5 ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取甲醇-鹽酸（20:1）混合溶液作為空白溶劑。分別精密吸取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。供試品溶液的色譜圖中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且空白溶劑無(wú)干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 取濃度為6.16 μg/ml橙黃決明素和濃度為5.24 μg/ml大黃酚混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2，5，10，15，20，25 μl，測(cè)其峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得橙黃決明素回歸方程為Y=3339.7X-225.71（r=0.999 99），大黃酚回歸方程為Y=8473.9X-1530.2（r=0.999 99）。結(jié)果表明，橙黃決明素和大黃酚分別在進(jìn)樣量為12.32～154 ng，10.48～131 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液與供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，各連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)定峰面積，得對(duì)照品溶液中橙黃決明素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.19 %，0.13 %（n=5）；供試品溶液中橙黃決明素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.12 %，0.08 %（n=5）。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別在室溫放置入0，1，2，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)照品溶液中橙黃決明素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.22 %，0.27 %（n=6）；供試品溶液中橙黃決明素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.04 %，0.15 %（n=6）。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液與供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：160501）6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得橙黃決明素平均含量為3.420 mg/g，RSD為0.56 %（n=6）；大黃酚平均含量為2.503 mg/g，RSD為0.47 %（n=6）。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：160501）6份，各約0.1 g，精密稱定，分別精密加入濃度為14.59 μg/ml橙黃決明素對(duì)照品溶液25 ml和濃度為10.32 μg/ml大黃酚對(duì)照品溶液25 ml，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率；結(jié)果得橙黃決明素的平均回收率為99.88 %（n=6），RSD為0.75 %；大黃酚的平均回收率為101.07 %（n=6），RSD為0.10 %。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2.3.7 耐用性試驗(yàn) 為考察色譜柱對(duì)測(cè)定成分的分離情況，進(jìn)行色譜柱耐用性試驗(yàn)，即取同一供試品選用不同生產(chǎn)廠家、不同型號(hào)的色譜柱按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果橙黃決明素平均含量是3.402 mg/g，RSD是0.48 %；大黃酚平均含量是2.501 mg/g，RSD是0.40 %；且在不同色譜柱上，待測(cè)定成分峰分離良好。結(jié)果表明，此法耐用性符合要求。

2.4 含量測(cè)定

取3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 橙黃決明素回收率測(cè)定結(jié)果

表2 大黃酚回收率測(cè)定結(jié)果

表3 橙黃決明素、大黃酚測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

中國(guó)藥典2015年版一部決明子藥材項(xiàng)下是以橙黃決明素和大黃酚為檢測(cè)指標(biāo)，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1 %磷酸為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫，以284 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定含量，梯度運(yùn)行時(shí)間表是40 min，以乙腈-甲醇-0.1 %磷酸（49:7:44）為流動(dòng)相，采用等度洗脫，在30 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定橙黃決明素與大黃酚，所測(cè)定的色譜峰與相鄰峰的分離度都達(dá)到1.5以上，此流動(dòng)相方便、省時(shí)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)橙黃決明素和大黃酚的色譜峰分別進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明：橙黃決明素最大吸收峰在285 nm處（見(jiàn)圖2）；而大黃酚有3個(gè)吸收峰，在225，257和287 nm，其中225 nm處的色譜峰最靈敏（見(jiàn)圖3）。

從兩成分的檢出靈敏度、檢測(cè)成本及操作的便利性考慮，采用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)同一針樣品，分別在222，285和254 nm波長(zhǎng)下，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖2 橙黃決明素光譜掃描圖

圖3 大黃酚光譜掃描圖

表4 同一供試品在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的兩成分含量比較

從兩成分的含量來(lái)看，兩種成分含量相差不大，在222 nm進(jìn)行檢測(cè)，兩峰的檢出靈敏度均較好，所以選擇222 nm作為橙黃決明素和大黃酚的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 供試品溶液的制備

比較了提取溶劑的水解酸度、回流水解的提取時(shí)間對(duì)橙黃決明素、大黃酚含量的影響，結(jié)果表明，采用甲醇:鹽酸（20:1）為提取溶劑，80 ℃水浴回流水解30 min時(shí)，橙黃決明素、大黃酚含量最高。

3.4 供試品溶液制備方法與藥典制備方法的比較

參考中國(guó)藥典決明子項(xiàng)下制備方法，對(duì)決明子配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚含量進(jìn)行測(cè)定，并與選定的供試品溶液制備方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者測(cè)得橙黃決明素、大黃酚的含量相差不大，而選用的制備方法既減少了有毒溶劑三氯甲烷的使用，又節(jié)約了供試品溶液制備時(shí)間，降低了檢驗(yàn)成本。

綜上所述，本文采用HPLC測(cè)定決明子配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚含量，方法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性好，可用于決明子配方顆粒中橙黃決明素、大黃酚的質(zhì)量控制。