劉小雨，常鴻彥，朱雪粉，逯海燕，王迎春，劉愛(ài)明，徐玲玲，王 芳，戚 敏，王本偉,3

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 新藥評(píng)價(jià)中心，山東 濟(jì)南 250101；2.山東力諾制藥有限公司，山東 濟(jì)南 250101；3.山東安捷生物檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

非布索坦是一種新型的非嘌呤類選擇性黃嘌呤氧化酶（XO）抑制劑，是目前廣泛用于治療伴有高尿酸血癥痛風(fēng)患者的新藥。臨床通常用于痛風(fēng)治療的別嘌醇只對(duì)XO的氧化形式有抑制作用，用于痛風(fēng)治療時(shí)需較大劑量維持血藥濃度而導(dǎo)致藥物蓄積和毒性[1-3]。非布索坦的作用不依賴于XO的氧化還原狀態(tài)，不作用于嘌呤和嘧啶代謝途徑中的相關(guān)酶，不影響嘌呤和嘧啶的正常代謝。臨床研究顯示，在各器官功能正常的患者中，非布索坦與別嘌呤相比，降低尿酸的作用更持久，安全性和有效性更好[4-7]。目前關(guān)于非布索坦的開(kāi)發(fā)研究較多，建立一種簡(jiǎn)單、可靠、重現(xiàn)性好的濃度檢測(cè)方法對(duì)其非臨床藥動(dòng)學(xué)研究、毒動(dòng)學(xué)研究具有重要的指導(dǎo)意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AB SCIEX ExionLC-Triple Quad 4500液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)SCIEX公司），包括工作站控制系統(tǒng)，脫氣機(jī)，ExionLC AC二元高壓泵，ExionLC AD Multiplate自動(dòng)進(jìn)樣器，ExionLC AC柱溫箱，Triple Quad 4500系統(tǒng)及Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)采集軟件；Z216MK高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle）；Advantage A10 Milli-Q超純水機(jī)（德國(guó)Merck）；Vortex Genius 3渦旋儀（德國(guó)IKA）。

1.2 材料

非布索坦（批號(hào)：20170910，純度99.6 %，山東省藥學(xué)科學(xué)院）；地西泮（批號(hào)：171225-201304，純度99.9 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical）；甲酸（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical）；超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，18只，體重230～260 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，在溫度25 ℃、濕度60 %±5 %條件下飼養(yǎng)一周。隨機(jī)分為3組，每組6只，分別灌胃給藥2，5，10 mg/kg的非布索坦。于藥前0 h，藥后5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，24 h，48 h頸靜脈取血0.2 ml，置1.5 ml涂肝素鈉的尖底離心管中，4 ℃、4000 r/min離心10 min，取上層血漿，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS條件

色譜柱：Thermo Accucore C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）。色譜條件：流動(dòng)相為0.1 %甲酸-水（A）與乙腈（B）；洗脫梯度：0～0.8 min，10 %～95 % B；0.8～2.0 min，95 % B；2.01～3.0 min，10 % B；分析時(shí)間3 min。流速：0.55 ml/min；進(jìn)樣量：2 μl；柱溫：45 ℃。

質(zhì)譜條件：離子化方式：電噴霧-正離子；氣簾氣：35 psi；離子化溫度：500 ℃；離子化電壓：5000 V；霧化氣：50 psi；輔助加熱氣：55 psi。監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。非布索坦定量離子對(duì)為 [M+H]+m/z317.1/261.1，去簇電壓90 V，碰撞能量55 eV；內(nèi)標(biāo)地西泮定量離子對(duì)為[M+H]+m/z285.1/193.1，去簇電壓150 V，碰撞能量35 eV。

2.2 樣本處理

從-80 ℃冰箱取出血漿樣本，室溫解凍，取20 μl，置于1.5 ml離心管中，加入180 μl乙腈（含內(nèi)標(biāo)地西泮20 ng/ml），渦旋混勻2 min，8 ℃下、13 000 r/min離心5 min，取上清，進(jìn)樣檢測(cè)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 取空白血漿20 μl，加入180 μl乙腈，按2.2項(xiàng)下方法操作，得空白質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1A）。取空白血漿20 μl，按2.2項(xiàng)下方法操作，得內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1B）。取16 μl/ml非布索坦標(biāo)準(zhǔn)液5 μl，加空白血漿95 μl，渦旋后取20 μl，加入180 μl乙腈，按2.2項(xiàng)下方法操作，得非布索坦質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1C）。取給藥后0.5 h的血漿樣品20 μl，按2.2項(xiàng)下方法操作，得血漿樣品質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1D）。非布索坦和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.44 min和1.37 min，內(nèi)源性物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)均不干擾待測(cè)物的準(zhǔn)確定量。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取0.2，0.5，2，5，20，50，100，200 μg/ml的非布索坦標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μl，加入空白血漿95 μl，渦旋得10，25，100，250，1000，2500，5000，10 000 ng/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，按2.2項(xiàng)下方法操作處理。以非布索坦的濃度為橫坐標(biāo)x，非布索坦與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)y，用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/x2）進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=0.000312x+0.00176，r=0.9978。表明非布索坦在10～10 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別取0.2，0.6，16，160 μg/ml的非布索坦標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl，加空白血漿190 μl，渦旋得10，30，800，8000 ng/ml 4個(gè)濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，按2.2項(xiàng)下方法操作，每一濃度6個(gè)平行樣本，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得非布索坦的濃度，并計(jì)算其批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度。連續(xù)處理3個(gè)分析批，計(jì)算非布索坦的批間準(zhǔn)確度和精密度。批間和批內(nèi)準(zhǔn)確度（RE）在91.1 %～115.6 %范圍內(nèi)，精密度RSD小于16.7 %，均符合2015版藥典對(duì)生物樣本的檢測(cè)要求。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.4 回收率和基質(zhì)效應(yīng)

圖1 非布索坦和內(nèi)標(biāo)的MRM質(zhì)譜圖

表1 非布索坦的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度與精密度

2.3.4.1 回收率 分別取低（30 ng/ml）、中（800 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl，加180 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液20 μl，再加入空白基質(zhì)提取液160 μl，渦旋混勻后檢測(cè)，每一濃度6個(gè)平行樣本，峰面積記為Set1；分別取0.6，16、160μg/ml的非布索坦標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl，加空白血漿190μl，渦旋得低（30 ng/ml）、中（800 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3個(gè)濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，按2.2項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，每一濃度6個(gè)平行樣本，峰面積記為Set2。以Set2/Set1計(jì)算回收率。

2.3.4.2 基質(zhì)效應(yīng) 分別取低（30 ng/ml）、中（800 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，按2.2項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，每一濃度6個(gè)平行樣本；峰面積記為Set3。以Set1/Set3計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)?；厥章屎突|(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，非布索坦在各濃度下提取回收率一致，基質(zhì)因子符合要求。

表2 非布索坦和內(nèi)標(biāo)的回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

2.3.5 穩(wěn)定性考察 分別取0.6，160 μg/ml的非布索坦標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl，加空白血漿190 μl，渦旋得低（30 ng/ml）、高（8000 ng/ml）兩個(gè)濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，每一濃度6個(gè)平行樣本，分別考察凍融循環(huán)穩(wěn)定性（-80 ℃和室溫凍融循環(huán)3次）、室溫短期6 h穩(wěn)定性、長(zhǎng)期30 d穩(wěn)定性（-80 ℃長(zhǎng)期存放）和樣品制備后24 h自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性（15 ℃）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 非布索坦的穩(wěn)定性（n=6）

2.3.6 稀釋效應(yīng) 制備20 μg/ml的血漿樣本，用空白血漿稀釋5倍，然后取20 μl，按2.2項(xiàng)下方法操作，平行測(cè)定6個(gè)樣本，結(jié)果準(zhǔn)確度（RE）均值為88.6 %，精密度RSD為4.6 %。說(shuō)明高濃度血漿樣本經(jīng)過(guò)5倍稀釋后不影響待測(cè)物準(zhǔn)確定量。

2.3.7 殘留 取空白血漿20 μl，按2.2項(xiàng)下方法操作制備得到殘留樣本，在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)樣本后進(jìn)樣殘留樣本，結(jié)果表明殘留樣本峰面積小于定量下限峰面積的20 %，符合要求。

2.4 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

取-80 ℃冷凍大鼠血漿樣本，室溫解凍，取20μl，置于1.5 ml離心管中，按2.2 項(xiàng)下方法操作，依隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣本的濃度。Phoenix 8.1計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。SD大鼠灌胃給藥2，5，10 mg/kg的非布索坦后，Cmax分別為1603.0，3470.2，7695.0 ng/ml，比值為1:2.2:4.8；AUC0-48h分別為10 186.1，22 427.5，65 671.5 h·ng/ml，比值為1:2.2:6.4。非布索坦在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰濃度和暴露量隨劑量升高基本成比例增加。平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 非布索坦藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 灌胃給藥后非布索坦的藥-時(shí)曲線

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究分別考察了不同的流動(dòng)相及色譜柱，最后流動(dòng)相選擇0.1 %甲酸-水和乙腈，此條件下峰形較好，出峰時(shí)間適中，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物的準(zhǔn)確定量；色譜柱選擇Thermo Accucore C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm），該色譜柱具有柱效高，柱壓低，分析時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)。

3.2 樣本處理

血漿樣本處理采用乙腈沉淀蛋白法，方法簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)易，能達(dá)到較高的響應(yīng)且不具有基質(zhì)效應(yīng)，能滿足高通量分析要求。血漿樣本用量少，靈敏度高。

3.3 采樣時(shí)間優(yōu)化

SD大鼠灌胃給予非布索坦后，在體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線中，3～4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分布在吸收相，4～5個(gè)以上時(shí)間點(diǎn)分布在消除相，AUC0-48h/AUC0-∞均大于99.0 %，說(shuō)明采集時(shí)間點(diǎn)選擇較合理。

3.4 非布索坦藥動(dòng)學(xué)特征

非布索坦灌胃給予大鼠后達(dá)峰時(shí)間為1.3～2.0 h，半衰期為5.7～7.8 h，吸收較快，消除較慢。文獻(xiàn)報(bào)道的人體中達(dá)峰時(shí)間為0.5～1.3 h[8]，半衰期為9.4 h[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非布索坦具有良好的藥動(dòng)學(xué)特征，可避免臨床患者頻繁服藥引起不適。

本研究基于HPLC-MS/MS技術(shù)，建立了非布索坦在大鼠血漿中濃度的檢測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)血藥濃度，且血漿用量少，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于非布索坦藥動(dòng)學(xué)研究。