張麗麗 李 雁 李 龍

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036）

心力衰竭是缺血性心臟病，臨床主要表現為心功能障礙和呼吸困難，病理特點是心肌細胞受損和凋亡。本病遷延難愈、預后極差，發(fā)病率、致殘率、病死率均處于較高水平，患者生命健康遭受嚴重威脅［1］。多數心血管疾病末期表現為心力衰竭，其中急性心肌梗死后心力衰竭發(fā)生率高達60%，為心衰首要病因［2］。心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）和心肌鈣蛋白（cTnI）是心肌細胞受損的重要標志物，能靈敏反映心肌能量代謝狀況，對于判斷和預測心衰療效具有積極意義［3-4］。心肌能量代謝藥物曲美他嗪在治療初期對于心梗后心衰雖具有較好的治療效果，但后期作用不明顯、預后依然較差［5］。加味溫膽湯具有健脾祛痰化飲、活血祛瘀之功效，可針對心衰的病因病機對癥治療。大量動物實驗結果提示加味溫膽湯能從根本上改善心肌能量代謝狀況和心肌超微結構，并具有療效好、副作用少、維持時間長的優(yōu)點［6-7］，但目前仍缺少對心梗致心衰病能量代謝和心肌超微結構療效和作用機制的臨床研究和動物實驗。本課題組通過對HFMI大鼠模型給藥治療評估加味溫膽湯對大鼠心肌能量代謝水平和心肌超微結構的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取12周齡清潔級SD雄性大鼠30只，與湖南斯萊克景達實驗動物有限公司共同飼養(yǎng)和實驗，實驗前經體檢所選大鼠均身體健康、心臟功能正常，預計生存期大于6個月，體質量（200±20）g。造模前適應性籠養(yǎng)5 d，溫度（25±2）℃，濕度45%～70%，飼料符合《GB14924.3-2010》標準，飲用水為純凈水，實驗周期8～10周。

1.2 實驗藥物

加味溫膽湯，組成：法半夏、陳皮各9 g，茯苓12 g，甘草、膽星各3 g，竹茹、蒼術、延胡索、丹參、川芎、赤芍各6 g，牛膝12 g，黃芪、節(jié)菖蒲各6 g。由黑龍江省中醫(yī)藥科學院制劑室加工而成，制作工藝為標準制干浸膏，每克干浸膏相當于生藥8.62 g。曲美他嗪片（瑞陽制藥有限公司，國藥準字H20066534）。

1.3 試劑與儀器

氯化鈉（分析純，CAS：7647-14-5，江蘇科倫多食品配料有限公司）；苯巴比妥注射液（福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司，國藥準字H20057384）；青霉素注射液［石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司，國藥準字H13021632］。大鼠cTnI、PGC-1α酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒分別購自廣銳生物和上海滬震生物科技有限公司；10%甲醛溶液（南京化學試劑股份有限公司）。Varioskan LUX多功能酶標儀：賽默飛；LS-20ECG動物心電圖記錄分析儀（北京拜安吉科技有限公司）；S5獸用B超機［大為醫(yī)療（江蘇）有限公司］；JIDI-4D-WS離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；奧林巴斯生物顯微鏡CX43（上海）；HX-300S小型動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；Leica RM2235石蠟包埋切片機（徠卡）；大小鼠脈搏血氧呼吸監(jiān)護儀（玉研儀器）；Latheta LCT 200小動物CT機（日立阿洛卡）；BSA124S天子天平（賽多利斯）；-80℃超低溫冰箱（Thermo公司）。

1.4 模型制備

選取大鼠30只，采用隨機數表法分為兩組，每組15只。造模組通過手術結扎冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗大鼠死模型：以40 mg/kg劑量腹腔注射2%苯巴比妥溶液麻醉大鼠，手術取仰臥位，術前在大鼠頸、胸部常規(guī)消毒、備皮，于大鼠心臟端連接Ⅱ導聯心電圖監(jiān)測心電指數，從頸部開始，沿氣管術方向做3 cm縱切口，鈍性分離頸部肌肉組織，暴露氣管后插管，連接呼吸機；用無創(chuàng)性線結扎冠狀動脈左前降支（LAD），以結扎部位遠端心肌變白、心搏減弱、心電圖出現ST段弓背抬升為急性心肌梗死成功標志。假手術組完成穿刺但并未結扎左前降支。兩組操作完成后排凈胸腔氣體，縫合切口并消毒，術后肌肉注射20萬U青霉素預防感染。術后飼養(yǎng)72 h，對兩組大鼠進行心衰評分，若結扎造模組大鼠符合Framingham慢性心衰診斷標準證明造模成功，兩組大鼠術后心衰評分結果見表1。假手術組作為篩選造模組所用的對照組，不計入后續(xù)分組研究。

表1 兩組大鼠術后72 h Framingham慢性心衰評分結果比較（分，±s）

表1 兩組大鼠術后72 h Framingham慢性心衰評分結果比較（分，±s）

符合兩項主證或主、次證各1項或次證超過3項，Framingham評分大于1.5分

組別造模組假手術組n 2～3分 ＞3分15 15 0～1分0 12 1.5～2分10 3 5 0 0 0

1.5 給藥方法

術后72 h將造模成功的15只大鼠隨機分為3組，各5只。模型對照組給予生理鹽水4 mL/kg灌胃，每日1次；曲美他嗪組給予曲美他嗪溶液10 mg/kg灌胃；中藥組加味溫膽湯10 mg/kg灌胃。每日9∶00～10∶00間灌胃給藥，持續(xù)4周，每周對大鼠稱體質量。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 大鼠心功能檢測 分別在給藥前（術后72 h）、給藥后4周采用小動物多普勒彩超對3組大鼠的心功能指標進行測量。腹腔注射2.0%苯巴比妥進行麻醉，仰臥位固定，于大鼠左胸前乳頭肌前對左室進行掃描，探頭頻率7～15 MHz，測量左室舒張末容積（LEDV）、左室收縮末容積（LES），左室射血分數（LVEF）=（LEDVLES）×100%/EDV，即大鼠每搏輸出量占心室舒張末期容積量的百分比，LVEF正常值＞50%。

1.6.2 大鼠心肌能量代謝因子檢測 在給藥前（術后72 h）、給藥后4周，麻醉大鼠并在鼠尾靜脈抽取靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min，將血清標本置于-80℃超低溫冰箱凍存待測。按照試劑盒說明書，應用雙抗夾心法測定大鼠心肌能量代謝因子（血清cTnI、PGC-1α）的濃度，利用酶標儀測定OD（吸光度值）并利用標準曲線計算出血清蛋白濃度，檢測波長為450 nm。

1.6.3 大鼠心肌超微機構完整性（MUS）評分方法 在第4周末次給藥后采血，腹腔注射2%苯巴比妥溶液麻醉大鼠，快速開胸腔、剪開心包，取出心臟，用生理鹽水溶液反復沖洗心臟至溶液變清無血液，將心臟浸入10%甲醛溶液中，經橫斷面剔除心臟左室中部組織經脫水、石蠟包埋、修片、切片、裱片、烤片后進行HE染色（核染）和Masson染色（纖染），染色后心肌細胞核呈藍褐色，膠原纖維呈藍色。心肌超微結構完整性評分：1分為心肌細胞排列整齊，心肌小動脈周圍及心肌細胞間隙可見少許膠原纖維；2分為心肌結構正常，但心肌膠原增多；3分為心肌細胞輕微水腫，心肌膠原少量沉積于心肌組織、小動脈附近；4分為心肌細胞肥大、排列紊亂，心肌組織及小動脈周圍有較多膠原沉積，并有向心肌細胞間隙伸展的趨勢。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS23.0軟件對研究資料進行統(tǒng)計學分析，組內兩組資料配對比較采用單因素方差分析，組間計量資料（）配對比較采取t檢驗，計數資料（%）做χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組HFMI大鼠心功能比較

見表2。治療后，中藥組和曲美他嗪組大鼠心功能指標LVEF、LES增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且治療后中藥組LVEF高于曲美他嗪組，LES低于曲美他嗪組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組HFMI大鼠LVEF、LES數值比較（%，±s）

表2 各組HFMI大鼠LVEF、LES數值比較（%，±s）

與模型對照組治療后比較，*P＜0.05；與曲美他嗪組比較，△P＜0.05。下同

組別 時間LVEF LES中藥組（n=5）曲美他嗪組（n=5）模型對照組（n=5）治療前治療后治療前治療后治療前治療后54.39±4.18 75.26±5.27*△54.28±4.24 66.89±5.06*54.43±4.26 47.18±4.49△24.37±4.12 35.25±5.22*△24.28±3.54 46.56±5.01*24.46±3.78 37.75±4.46△

2.2 各組HFMI大鼠心肌能量代謝指標比較

見表3。治療前，3組大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療4周后，中藥組、曲美他嗪組大鼠血清cTnI、PGC-1α水平均較治療前顯著降低（P＜0.05），模型對照組上述指標水平則與治療前相比有提升，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后中藥組大鼠血清cTnI、PGC-1α水平均低于曲美他嗪組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組HFMI大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比較（±s）

表3 各組HFMI大鼠血清cTnI、PGC-1α水平比較（±s）

組別中藥組（n=5）曲美他嗪組（n=5）模型對照組（n=5）時間治療前治療后治療前治療后治療前治療后cTnI（μg/L）65.64±4.02 54.23±3.27*△65.56±4.17 59.55±3.85*65.61±4.11 67.89±3.96△PGC-1α（ng/mL）8.17±1.24 4.28±0.75*△8.24±1.08 6.36±0.82*8.21±1.19 9.02±2.02△

2.3 各組HFMI大鼠心肌超微結構比較

見表4，圖1～圖2。治療4周后，各組大鼠血清MUS比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）：中藥組＜曲美他嗪組＜對照組。

表4 各組HFMI大鼠心肌超微結構完整性評分比較（分，±s）

表4 各組HFMI大鼠心肌超微結構完整性評分比較（分，±s）

組別n 5 5中藥組曲美他嗪組1 2 MUS 5模型對照組.28±0.25△.43±0.36*3.56±0.32△

圖1 各組大鼠治療4周后心肌組織形態(tài)學（HE染色，100倍）

圖2 各組大鼠治療4周后心肌組織形態(tài)學（Masson染色，100倍）

3 討 論

急性心肌梗死、心肌炎、高血壓病、高脂血病、糖尿病等心血管疾病均能誘發(fā)心力衰竭（心功能障礙），其中急性心肌梗死導致的心力衰竭占60%～70%，是最為主要的病因，這與急性心肌梗死可對心肌細胞造成嚴重損害，繼而引發(fā)心肌能量代謝紊亂、心肌超微結構發(fā)生改變有密切關聯［10-12］。大量研究提示，線粒體是參與心肌能量代謝的重要細胞器，可生成關鍵調控因子PGC-1α，一方面，PGC-1α參與糖脂能量代謝，可維持血氧供應正常水平、抑制能量代謝紊亂，但PGC-1α濃度過高可誘發(fā)糖脂代謝紊亂［13］；另一方面由PGC-1α主導的信號調控通路也有助于修復和保護心肌細胞、血管內皮細胞，從而有效預防心室重構、減少再灌注損傷。此外，cTnI水平變化對于心肌損傷極為敏感（特異性達91%、敏感性達100%）［14］，cTnI水平升高可提升心肌損傷，且數值越高，損傷越大。上述兩項指標均有助于反映心肌能量代謝和心肌超微結構。針對上述病因機制，西醫(yī)從優(yōu)化心肌能量代謝入手應用了一些西藥，取得了不錯的成果，如曲美他嗪就是一種能夠優(yōu)化心肌能量代謝的藥物，該藥有助于抑制氧化應激、抑制心肌細胞凋亡。但臨床數據顯示，應用曲美他嗪治療心力衰竭雖然能夠在治療初期（大鼠心衰后1～2周）取得較大進展，但在后期（大鼠心衰后4～6周）的療效不夠明顯，特別是對于心肌超微結構的改善不足，這也說明還要繼續(xù)尋找更加安全有效的用藥方案。

中醫(yī)學將心力衰竭歸為“心痹”“心水”“心咳”范疇，認為情志不調、飲食不節(jié)為外因，心腎陽虛和氣滯血瘀為內因。加味溫膽湯具有健脾祛痰化飲、活血祛瘀之功效，可針對心梗后心衰患者的病機病因對癥治療。從組方上分析，茯苓歸心、肺、脾、腎經，可利水滲濕、健脾寧心，為君藥，主治肺水腫、心悸、胸悶氣喘、失眠、煩躁，法半夏辛溫，燥濕化痰，和胃止嘔；臣藥竹茹、陳皮、枳實，竹茹甘而微寒，清熱化痰，除煩止嘔。茯苓健脾滲濕，杜生痰之源；生姜、大棗協(xié)調脾胃，生姜兼制法半夏毒性。使藥甘草協(xié)調諸藥。歸納全方，法半夏、陳皮、生姜偏溫，竹茹、枳實偏涼，溫涼兼進，令全方不寒不燥，理氣化痰以和胃，胃氣和降則膽郁得舒，痰濁得去則膽無邪擾，如是則復其寧謐，諸癥自愈。現代藥理研究則表明，加味溫膽湯中富含黃酮類、多糖類、皂苷類、生物堿類等化合物，其中甘草的甘露醇具有利尿功效；多糖類化合物可降壓降糖、調節(jié)免疫力；皂苷和黃酮類成分則具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、護肝的藥理活性。此外，從生物學角度，加味溫膽湯治療心衰的機制還包括β淀粉樣蛋白（Aβ）清除與抗神經炎癥、調控脂質代謝和胰島素抵抗、保護心肌細胞、促進心肌重構和調節(jié)水電解質平衡等。

本次動物實驗的結果也顯示，治療后中藥組大鼠心功能指標（LVEF）、心肌能量代謝因子（血清cTnI、PGC-1α）的改善水平差異具有統(tǒng)計學意義：中藥組優(yōu)于曲美他嗪組，曲美他嗪組優(yōu)于對照組。此外，治療4周后，各組大鼠心肌超微結構完整性評分比較差異也具有統(tǒng)計學意義：中藥組＜曲美他嗪組＜對照組。表明加味溫膽湯對急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌能量代謝具有促進作用，對心肌超微結構的完整性具有保護作用，并能有效改善大鼠的心功能，較曲美他嗪等西藥具有優(yōu)勢，值得進一步進行臨床試驗。