王瑩威 任廣杰 王 博 王殿明 劉璐菲 李敬孝，△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150036）

慢性心力衰竭（CHF）是各種心臟疾病發(fā)展到心功能受損的一種病理狀態(tài)，也是導致心血管疾病患者死亡的重要原因之一。2017年6月《中國心血管病報告2016》發(fā)布［1］，目前心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，隨著老齡化的進展，心力衰竭的發(fā)病率呈上升趨勢。目前中醫(yī)藥治療心衰具有很好療效，中成藥已被2014年中國心衰指南推薦使用［2］。CHF在中醫(yī)學中屬于“心痹”“心悸”“喘證”“水腫”等范疇，發(fā)病初期心氣虛，逐漸發(fā)展成心腎陽虛，進而心之氣血陰陽虛衰，臟腑功能失調，心失所養(yǎng)，氣虛血瘀，水飲內停，又加重心衰。李敬孝教授基于對該病病因病機的認識，提出治療當以溫陽補心為原則。本研究以溫陽補心湯干預p38MAPK/PPAR-γ通路CHF模型大鼠，探討在促進線粒體結構改變和改善衰竭心肌能量代謝方面的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，48只，體質量200～220 g，8周齡，黑龍江中醫(yī)藥大學動物中心提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（黑）2016-0035，嚴格遵循動物飼養(yǎng)規(guī)則進行統(tǒng)一喂養(yǎng)，自然光照，室溫（25±2）℃。實驗期間大鼠自由飲水、攝食，1周后用于模型制備。

1.2 試藥與儀器 琥珀酸美托洛爾由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)（批號J20180045）。溫陽補心湯：制附子10 g，白術 10 g，生姜 10 g，桂枝 10 g，黃芪 30 g，當歸10 g，茯苓 15 g，益母草 20 g，川芎15 g，紅花10 g（藥材由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥房提供）。飲片加入清水煎煮2次，第1次90 min，第2次30 min，然后濃縮為2 g/mL煎劑。三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、氨基末端B型鈉尿肽原（NT-proBNP）的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京卡米洛生物工程有限公司，批號分別為CEA349Ge，SFA6005AS，CEA3560Ge）；p38MAPK抗體（批號533216798）、p-p38MAPK抗體（批號00905860）、PPAR-γ抗體（批號5890623）。低溫高速離心機（美國BECKMANCOULTER公司），電泳槽（HE-120型），電泳儀（北京六一儀器廠），彩色多普勒超聲診斷儀（SIEMENS，探頭頻率為3.5）。

1.3 分組與造模 術前對48只大鼠進行多普勒彩超檢測，確定心功能無異常。采用腹主動脈縮窄法制作慢性心力衰竭大鼠模型。所有大鼠術前12 h禁食不禁水，予2.5%戊巴比妥鈉注入大鼠腹腔麻醉，手術板上仰臥位置麻醉，腹部劍突下正中縱向切口，分層打開腹腔，腹主動脈鈍性分離，沿腹主動脈找到腎動脈分支，在此處上方約2 mm，將7號注射針頭與4號可吸收手術線縫合，一起結扎，抽出針頭，關腹縫合，形成腹主動脈大約50%狹窄，假手術組僅分離腹主動脈，不進行縮窄術，其他操作與模型組相同。術后將大鼠放置單籠喂養(yǎng)，蘇醒后回籠。術后4周進行多普勒彩超檢測，以左室射血分數(shù)（LVEF）＜45%判定為造模成功，排除死亡與感染，造模成功后，將CHF大鼠隨機分為模型組、溫陽補心湯組、琥珀酸美托洛爾組，以及假手術組12只。

1.4 給藥方法 根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比值表”折算［3］，假手術組、模型組予0.9%氯化鈉注射液4 mL/（kg·d）灌胃，溫陽補心湯17.5 g/（kg·d）灌胃，琥珀酸美托洛爾4.27 mg/（kg·d）灌胃，各組均每日給藥1次，干預8周。

1.5 標本采集與檢測 1）ELISA法檢測大鼠外周血中ATP、ADP、NT-proBNP的含量。給藥8周后麻醉大鼠，于腹主動脈采血，具體步驟按試劑盒說明進行。2）Western blotting法檢測p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ。將100 μg蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳，電泳結束后設定轉膜電流為300 mA，轉膜1 h，轉膜完畢后，浸入5%脫脂奶粉TBST中避光封閉1.5 h；洗滌后進入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜，次晨洗滌后浸入二抗稀釋液中，室溫搖床孵育1 h，孵育結束，TBST洗脫ECL顯色曝光，分析結果。3）彩色多普勒超聲檢測大鼠心室功能。末次給藥后，對大鼠充分麻醉，將其平臥固定，將探頭置于胸骨左緣取左室長軸最大直徑處M型超聲標記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內膜位置，檢測左心室舒末內徑（LVDD）、左心室收縮末期內徑（LVDS）、左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室舒張末期后壁厚度（LVPWD）、左心室收縮末期后壁厚度（LVPWS），連續(xù)檢測5個心動周期，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料服從正態(tài)分布且方差齊以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中ATP、ADP、NT-proBNP含量的比較 見表1。與假手術組比較，模型組，溫陽補心湯組和琥珀酸美托洛爾組大鼠外周血清中ATP的含量顯著下降，ADP、NT-proBNP含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，溫陽補心湯組和琥珀酸美托洛爾組ATP含量上升，ADP、NT-proBNP含量下降（P＜0.05）。與琥珀酸美托洛爾組比較，溫陽補心湯組的ATP含量上升，ADP、NT-proBUP含量下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠ATP、NT-proBNP、ADP含量比較（±s）

表1 各組大鼠ATP、NT-proBNP、ADP含量比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與琥珀酸美托洛爾組比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術組模型組琥珀酸美托洛爾組溫陽補心湯組n 12 12 12 12 ATP（μg/L）762.50±180.96 389.39±157.97*466.50±269.60*△583.39±273.46*△▲NT-proBNP（ng/L）25.57±9.32 82.73±21.39*65.86±19.32*△49.17±17.65*△▲ADP（μg/L）235.59±52.43 590.76±121.72*372.45±95.60*△350.20±80.36*△▲

2.2 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比較 見表2。與假手術組比較，模型組、琥珀酸美托洛爾組和溫陽補心湯組p38MAPK、pp38MAPK蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），PPAR-γ蛋白表達水平明顯下降（P＜0.01），差異有顯著統(tǒng)計學意義；與模型組比較，溫陽補心湯組、琥珀酸美托洛爾組p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達水平下降（P＜0.05），PPAR-γ蛋白表達水平升高（P＜0.05）。琥珀酸美托洛爾組與溫陽補心湯組比較，上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白含量比較（±s）

組別假手術組模型組琥珀酸美托洛爾組溫陽補心湯組n 12 12 12 12 p38MAPK 0.190±0.019 0.760±0.059*0.632±0.028*△0.419±0.037*△p-P38MAPK 0.079±0.005 0.837±0.062*0.460±0.021*△0.271±0.025*△PPAR-γ 0.793±0.042 0.248±0.017*0.460±0.021*△0.589±0.028*△

2.3 各組大鼠心室功能相關指標的比較 見表3。與模型組比較，琥珀酸美托洛爾組和溫陽補心湯組LVDD、LVDS、LVEF、LVPWD、LVPWS均顯著改善（P＜0.05），且溫陽劑心湯組改善優(yōu)于琥珀酸美托洛爾組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠心室功能相關指標比較（±s）

表3 各組大鼠心室功能相關指標比較（±s）

組別假手術組模型組琥珀酸美托洛爾組溫陽補心湯組n 12 12 12 12 LVDD（mm）6.65±0.43 9.79±0.51*8.16±0.48△7.32±0.31△▲LVDS（mm）5.60±0.39 9.57±0.62*7.18±0.42△6.56±0.36△▲LVEF（%）87.64±17.32 36.51±5.68*52.62±6.64△61.23±6.83△▲LVPWD（mm）3.25±0.36 1.97±0.27*2.16±0.39△2.73±0.25△▲LVPWS（mm）4.62±0.63 1.20±0.27*2.13±0.37△2.68±0.51△▲

3 討 論

中醫(yī)學中雖未記載“心衰”病名，根據(jù)癥狀可將其歸于“心痹”“心悸”“喘證”“水腫”等范疇，異病同治。多認為慢性心衰的病機關鍵為陽虛血瘀，故治療原則多以溫陽補心為主，兼以化瘀利水［4］。心衰發(fā)病初期多為心氣虛，氣為血之帥，血為氣之母，氣虛致血液運行不暢，導致血瘀，從而加重心臟前后負荷，病程日久，心氣虛加重，氣虛久及陽虛，腎主相火，又稱“真陽”，心主君火，相火溫養(yǎng)君火，心腎相交，腎陽虛，則氣化不利，水飲內停，發(fā)為水腫，腎主納氣，腎氣充足，呼吸才能均勻，另《金匱要略》則開創(chuàng)性地提出了“血不利則為水”的論點［5］，《血證論》在此基礎上進一步指出“血積既久，其水乃成”，由此可以推論出：心氣虛致血瘀，血瘀又加重水停心下，引發(fā)出氣短氣不足以息、水腫、心悸等一系列癥狀［6］。李敬孝教授參考古文獻及現(xiàn)代研究，經(jīng)多年臨床觀察和總結，結合現(xiàn)代人飲食習慣、生活環(huán)境提出“溫陽補心”的治法，運用溫陽補心湯溫陽補心，化瘀利水。方中諸藥為真武湯合補陽還五湯加減，附子辛熱，桂枝溫通心陽，化飲利水，配生姜溫化水氣，白術茯苓以健脾利水，黃芪益氣升陽，利水消腫，中、大劑量黃芪可增加心肌收縮及舒張功能，當歸可以抑制心肌細胞凋亡，保護心肌細胞［7］，葶藶子、益母草通利水道，降低心臟負荷，改善心衰水腫癥狀［8］，川芎對心肌細胞具有保護作用，減輕缺血引起的心肌細胞損傷［9］，紅花可增加冠脈血流量，改善心肌缺血［10］。諸藥調配共奏溫陽化瘀利水之功。

本研究采用腹主動脈縮窄法制備CHF大鼠模型，超聲檢測CHF模型大鼠與假手術組比較，LVDD、LVDS水平升高，LVEF、LVPWD和LVPWS水平降低，ELISA結果顯示，與假手術組比較ATP表達降低，NT-proBNP、ADP表達升高，慢性心衰大鼠模型造模成功。目前已有研究證實，MAPK信號通路與慢性心衰、心肌梗死和心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關［11］。研究表明，DHF的發(fā)生常伴隨有線粒體結構改變和功能損傷，引起能量合成障礙，而作為細胞能量變化感受器的MAPK，在心肌線粒體結構改變中發(fā)揮著重要作用［12］。MAPK/PPAR在機體內是重要的調控因子，可調節(jié)下游多組通路，調控細胞凋亡、能量代謝等從而影響機體內各種疾病的發(fā)生發(fā)展［13］。p38MAPK作為MAPK家族的一個成員，是細胞外信號轉導的共同通路，幾乎與生物體中全部病生理過程有關，尤其是炎性反應、氧化應激等細胞反應過程。p38MAPK主要在細胞質內表達，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，正常生理狀況下活性較低，可調控基因表達及抗氧化損傷等［14］。p-p38MAPK轉移至核內，可磷酸化激活許多轉錄因子，調控多類靶基因［15］。Western blotting結果顯示，CHF大鼠與假手術組比較p38MAPK、p-p38MAPK表達上升，說明在CHF發(fā)生后，p38MAPK磷酸化作用過程加強，琥珀酸美托洛爾和溫陽補心湯干預后p38MAPK、p-p38MAPK表達較模型組比較降低，說明p38MAPK磷酸化過程被抑制。PPAR-γ屬于核因子超家族成員，為調節(jié)大量基因表達所必需的核受體［16］，研究結果顯示，CHF大鼠與假手術組比較PPAR-γ表達下降，說明在CHF發(fā)生后，PPAR-γ通路被抑制，琥珀酸美托洛爾和溫陽補心湯干預后，PPAR-γ表達較模型組上升，PPAR-γ蛋白被激活。

本研究表明，溫陽補心湯通過抑制p38MAPK、pp38MAPK蛋白，激活PPAR-γ通路，通過參與線粒體生物合成，調節(jié)線粒體數(shù)量和質量，促進能量生成，改善心臟能量代謝，進而改善心衰進展。