張會香，楊世軍，藍華生，蔡愛華

（1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室，廣西桂林541006；2.桂林理工大學化學與生物工程學院，桂林廣西541004）

百香果（passion flower）又稱西番蓮、雞蛋果，屬西番蓮科，西番蓮屬植物，原產(chǎn)澳大利亞和巴西，屬于熱帶多年生草質至半木質藤本攀附果樹，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前在中國的廣東、廣西、海南、福建等地有大量種植[1-2]。百香果果汁具有番石榴、菠蘿、香蕉、芒果、蘋果、酸梅等多種水果的令人愉悅的香味[3]。研究發(fā)現(xiàn)，百香果果殼中豐富的碳水化合物、多糖、黃酮和多酚類物質[4-5]。百香果果殼的乙醇、水提取物均能有效清除DPPH·和·OH，證明其提取物具有良好的抗氧化活性[5-7]。研究表明，黃酮類化合物是一類有著多方面藥理作用和生物活性的物質，在預防癌癥、抗過敏、抗炎癥、抗病毒、抗糖尿病并發(fā)癥等方面都具有活性，同時黃酮類化合物還是一種自然界存在的理想的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子的自由基、抗衰老、增加機體免疫等生物活性[8-9]。

目前對百香果應用除了部分鮮食之外主要用于加工果汁產(chǎn)品，因此，大量的果殼被作為殘渣廢棄掉，造成大量的浪費，同時又污染環(huán)境。

超聲波輔助提取法又被稱為超聲波萃取或者超聲波輔助萃取法，主要是利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速胞內(nèi)有效物質的釋放、擴散和溶解，顯著提高提取效率的方法[10-12]。且超聲輔助提取可節(jié)約溶劑，避免高溫對提取成分的影響。因此，目前在天然植物有效成分提取中超聲波輔助提取法被廣泛應用。

因此，本文通過單因素試驗及正交試驗，利用超聲波輔助乙醇提取法對百香果果殼中的黃酮類化合物進行提取并研究其抗氧化活性，為綜合開發(fā)利用百香果果殼提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果果殼（紫果）：桂林市雁山鎮(zhèn)。

無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、抗壞血酸、硝酸鋁：以上試劑均為分析純，西隴化工股份有限公司。

蘆?。╮utinhydrate）對照品、DPPH：美國 sigma 公司；聚酰胺樹脂（80 目～100 目）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；XH-300A 電腦微波超聲波組合合成/萃取儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；HL-2B 型恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；電腦全自動部分收集器：上海琪特分析儀器有限公司；TU-1950 型雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；PB-10 型酸度計、BS2245 型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FW100 型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2000A 型旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理及制備過程

選擇完整無破損的百香果，取下果殼，將其洗凈、烘干、粉碎、過80 目篩，置于干燥器中備用。

稱取一定量的干燥粉末樣品，按照一定比例的料液比加入不同濃度的乙醇，在一定的溫度和時間下進行超聲波輔助提取，將提取液抽濾，濾液即為黃酮粗提液。采用聚酰胺柱層析法進行黃酮粗提取的純化，上樣流速為0.5 mL/min，用蒸餾水、70%乙醇溶液進行順序洗脫，洗脫速度為1 mL/min，分段收集洗脫液，合并純化液進行旋轉蒸發(fā)濃縮，得到黃酮純化液，測定黃酮含量，得到的樣品純度為20.08 %，回收率為82.95%。

1.3.2 黃酮含量測定方法

精確稱量干燥至恒重的蘆丁標準品10.23 mg，用60 %乙醇加熱溶解定容至100 mL，得濃度為0.102 3 mg/mL 的蘆丁標準溶液。參考陳志紅等[13]報道的方法，以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標制作標準曲線。用最小二乘法做線性回歸，得到蘆丁濃度X 和吸光度Y 的關系曲線的回歸方程Y=13.532X-0.001 6，R2=0.999 8，線性范圍 5.115 μg/mL ～40.92 μg/mL。

準確吸取樣品溶液1 mL，用60%乙醇定容至5 mL置于10 mL 容量瓶中，按標準曲線的制備方法測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計算黃酮含量C（mg/mL）。黃酮提取率為黃酮質量與百香果果殼樣品質量之比。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

固定料液比為 1 ∶50（g/mL），超聲功率 200 W，超聲溫度30 ℃，超聲時間20 min，分別以30 %、40 %、50 %、60%、70%、80%的乙醇溶液為溶劑提取黃酮，比較不同濃度乙醇對提取率的影響。

1.3.3.2 料液比對黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度60%，超聲溫度30 ℃，超聲功率200 W，超聲時間20 min，分別設定料液比為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），比較不同料液比對提取率的影響。

1.3.3.3 超聲功率對黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL），超聲溫度 30 ℃，分別以 160、200、240、280、320、360 W 的超聲功率進行提取，比較不同超聲功率對提取率的影響。

1.3.3.4 超聲溫度對黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL），超聲功率 200 W，分別以 30、40、50、60、70、80 ℃的超聲溫度進行提取，比較不同超聲溫度對提取率的影響。

1.3.3.5 超聲時間對黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL）超聲功率 200 W，超聲溫度 60 ℃，分別以 20、30、40、50、60、70 min 的超聲時間進行提取，比較不同超聲時間對提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素的研究基礎上，選用L16（45）正交表，以黃酮提取率為指標，設計正交試驗，確定最佳提取條件。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The experimental factors and levels of orthogonal test

1.3.5 黃酮抗氧化活性的測定

1.3.5.1 水楊酸法測定黃酮抗氧化活性

采用Fenton 試劑法[14]，在10 mL 試管中分別加入1.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL、9 mmol/L 水楊酸 1.00 mL，分別加入 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的百香果黃酮提取液，另一支試管以蒸餾水為參比，做空白試驗比較，最后分別加9 mmol/L H2O21.00 mL 搖勻，加蒸餾水定容至10 mL，在37 ℃水浴中反應30 min，在510 nm 處測定吸光度?？紤]到提取液自身的吸光度，按前述同樣的方法，區(qū)別是不加H2O2，作為提取液的本底吸收AX0。同時配制相同濃度梯度的VC溶液為對照品，加入 1.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL、9 mmol/L 水楊酸1.00 mL、9 mmol/L H2O21.00 mL 搖勻，加蒸餾水定容至10 mL，在 37 ℃水浴中反應 30 min，在 510 nm 處測定吸光度。即為對照試驗結果，與黃酮提取物比較抗氧化活性大小。

計算公式：

式中：A0為空白對照組吸光度；AX為樣品組吸光度；AX0為提取液本底組吸光度。

1.3.5.2 DPPH 法測定黃酮抗氧化活性

參考王雅等[15]的方法在10 mL 試管中分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的百香果黃酮提取液和 3 mL現(xiàn)配的0.1 mmol/L DPPH 緩沖液，95 %乙醇定容至10 mL，混合均勻，另一只試管以95%乙醇為參比，做空白試驗比較。同時配制相同濃度梯度的VC溶液進行對照試驗?？紤]到提取液自身的吸光度，按前述同樣的方法，區(qū)別是不加DPPH，作為提取液的本底吸收Aj。

計算公式：

式中：AC為空白對照試驗吸光度；Ai為樣品吸光度；Aj為不加DPPH 提取液的本底吸光度。

1.3.5.3 鄰苯三酚自氧化法測定黃酮抗氧化活性

參考陳志紅[16]等的方法吸取不同濃度的黃酮提取液1 mL，分別加入pH8.2 濃度為50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，隨后加入4.2 mL 蒸餾水（自氧化）混勻，放置于25 ℃水浴鍋內(nèi)保溫20 min 后取出，立即加入事先預熱（25 ℃）的3 mmol/L 鄰苯三酚0.3 mL（用10 mmol/L 的HCl 配制）?？瞻自囼灲M加0.3 mL 10 mmol/L HCl 代替鄰苯三酚溶液。加入試劑后迅速搖勻，倒入比色皿中，在325 nm 下測定5 min 后的測定吸光度。同時配制相同濃度梯度的VC溶液作為對照品進行試驗。

計算公式：

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化的吸光度隨時間的變化值；ΔAX為加入樣品后溶液的吸光度隨時間的變化值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗結果得出乙醇濃度對黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of flavonoids

由圖1 可以看出，隨著乙醇濃度的增大黃酮提取率也不斷增大，在乙醇濃度為60%時黃酮提取率達到最大值，乙醇濃度超過60%提取率反而降低，說明百香果果殼中黃酮的極性與60%乙醇極性最接近，因此，可以最大程度地從固體材料中轉移到溶劑中。因此確定60%乙醇溶液為最佳提取溶劑。

2.1.2 料液比對黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗結果得出料液比對黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of ratio of material to solvent on extraction efficiency of flavonoids

由圖2 可知，隨著料液比的不斷增大，黃酮的提取率也逐漸上升，當料液比上升到1 ∶40（g/mL）時，提取率達到最大，之后，提取率開始下降。這可能是由于溶劑量的不斷增大，溶質與溶劑之間接觸的表面積不斷增加，加速了溶質的溶出，導致提取率增加。隨著溶劑量不斷加大到一定比例時，黃酮已經(jīng)基本完全從固體組織轉移到液體中。因此，試驗選用1 ∶40（g/mL）的料液比作為最佳料液比。

2.1.3 超聲功率對黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗結果得出超聲功率對黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on extraction efficiency of flavonoids

由圖3 可知，隨著超聲功率的不斷增大，黃酮的提取率也不斷升高，在超聲功率240 W 時黃酮提取量最大，之后隨著功率的增加，提取率趨于平穩(wěn)?？赡艿脑驗椋涸?60 W 到240 W 之間，隨著功率的增加，超聲波的能量不斷增大，分子運動不斷加快，導致黃酮的提取率增大；超聲功率超過240 W 后，過高的功率導致高溫，反而破壞了黃酮分子，導致黃酮提取率降低。因此，選取240 W 作為試驗的最佳超聲功率。

2.1.4 超聲溫度對黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗結果得出超聲溫度對黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on extraction efficiency of flavonoids

從圖4 可以看出，黃酮提取率隨超聲溫度增大而不斷增大，在60 ℃時達到最大值，此后隨著溫度再升高提取率反而降低。這主要是因為溶劑分子運動速度與溫度正相關，溫度越高速度就越快。所以黃酮類溶質分子的擴散運動加快，溶解速度增加，導致提取率不斷增加。而溫度超過一定極限后，黃酮類物質分子結構被破壞，導致黃酮提取率降低，且溫度過高容易導致物質活性喪失，因此選用60 ℃作為最佳提取溫度。

2.1.5 超聲時間對黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗結果得出超聲時間對黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic time on extraction efficiency of flavonoids

由圖5 可知，隨著提取時間的增加，黃酮提取率不斷增大，且在50 min 時達到最大值，之后變化趨于平穩(wěn)。這主要的原因是：溶劑提取有效成分的動力是溶劑內(nèi)外存在濃度差，在提取的初始階段，濃度差較大，隨著時間延長有效成分會迅速進入溶劑中，提取率就不斷增大；隨著時間繼續(xù)延長濃度差會不斷減小，提取率就基本保持不變了。因此，從經(jīng)濟的角度考慮，選取超聲時間50 min 為最佳提取時間。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果設計正交試驗，試驗因素水平見表1，通過試驗得出正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2 的極差分析可知，乙醇濃度對提取率的影響最大，各因素對黃酮提取效果影響的主次順序為：乙醇濃度＞超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率＞料液比，最佳提取工藝條件為A3B1C2D2E2，即60 %乙醇，料液比1 ∶30（g/mL），超聲功率 240 W，超聲溫度 50 ℃，超聲時間40 min。

因為最佳參數(shù)A3B1C2D2E2在正交試驗中沒有出現(xiàn)，所以進行驗證試驗，結果見表3。

表3 驗證試驗結果Table 3 The results of verification test

從表3 可以看出驗證試驗中黃酮的提取率為8.084 0 mg/g，大于正交試驗的最大黃酮提取率7.914 6 mg/g，說明最佳提取工藝A3B1C2D2E2確為最佳。

對百香果果殼樣品進行索氏提取，在90 ℃水浴鍋中采用60%乙醇提取，待虹吸5 次后結束提取，用時3 h 10 min，黃酮提取率為5.669 5 mg/g。明顯小于超聲提取法黃酮提取率8.084 0 mg/g。因此，與索式提取方法相比，超聲波輔助乙醇提取法具有用時更短，效率更高，成本更低等優(yōu)點。

2.3 黃酮抗氧化活性的研究

2.3.1 水楊酸法測抗氧化活性

對不同濃度的黃酮提取物進行水楊酸法測定抗氧化活性，以相同濃度的VC做對照，試驗結果見圖6。

圖6 黃酮對·OH 的清除率的影響Fig.6 The effect of·OH clearance on flavonoids

由圖6 可知，隨著濃度的不斷增加，黃酮對·OH的清除率不斷升高，在試驗范圍的最大濃度0.44 mg/mL時清除率達到58.66%，而同濃度的VC在清除·OH 自由基能力方面要明顯小于黃酮，說明百香果果殼中黃酮對羥自由基有較好的清除能力。

2.3.2 DPPH 法測抗氧化活性

對不同濃度的黃酮提取物進行DPPH 法測定抗氧化活性，以相同濃度的VC做對照，試驗結果見圖7。

圖7 黃酮對DPPH 自由基的清除率的影響Fig.7 The effect of the scavenging rate of DPPH on flavonoids

由圖7 可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的不斷增加，對DPPH 自由基的清除率從54.7%增加到93.81%。與同濃度的VC相比較，黃酮的清除率小于VC的清除率（95.42%），但可以看出，在最大濃度時，百香果黃酮對DPPH 自由基的清除能力接近于VC的清除水平。說明黃酮對DPPH 自由基有很強的清除能力。

2.3.3 鄰苯三酚自氧化法測抗氧化活性

經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，當樣品濃度為0.044 mg/mL 時，黃酮與VC對超氧陰離子自由基的清除率高達100 %，無法做出比較。因此將樣品濃度繼續(xù)稀釋至0.026 4、0.017 6、0.008 8 mg/mL 3 個濃度梯度，黃酮與VC對超氧陰離子自由基的清除率，結果見圖8。

圖8 不同濃度黃酮對O2-·的清除率的影響Fig.8 The effect of the clearance rate of O2-·on different concentrations of flavonoids

由圖8 可知，百香果果殼中的黃酮和VC都對O2-·有清除作用，且清除效果與添加的劑量成正相關，隨著樣品濃度的增加，對O2-·的清除率也隨著增大。試驗結果說明黃酮清除O2-·自由基的能力略低于VC，但是黃酮的最大清除率仍然達到了82.61%，說明黃酮在清除超氧陰離子自由基方面同樣表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

3 結論

通過試驗確定了超聲波輔助法提取黃酮的最佳工藝條件為50 ℃條件下，選擇60%乙醇為提取劑、料液比 1 ∶30（g/mL）、超聲 40 min，超聲功率 240 W，此條件下提取的百香果果殼黃酮含量可達8.084 mg/g。與傳統(tǒng)提取工藝相比，超聲波輔助法明顯提高了百香果果殼黃酮的提取效果和含量，提取效果優(yōu)于乙醇回流提取工藝，是一種高效、節(jié)能、省時的提取百香果果殼黃酮工藝。

提取后的樣品經(jīng)過聚酰胺層析柱純化，對純化的黃酮化合物利用水楊酸法測定對羥基自由基的清除能力、DPPH 法與鄰苯三酚自氧化法來測定超氧陰離子自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)黃酮濃度為0.44 mg/mL時，對羥基自由基的清除率可達58.66%；對DPPH 自由基的清除率可達93.81%；對超氧陰離子自由基的清除率甚至可達100%。相比較于同濃度的VC而言，黃酮對羥基自由基的清除能力遠遠大于VC；對DPPH自由基的清除能力相當；對超氧陰離子自由基的清除能力低于VC。試驗結果證明了百香果果殼黃酮具有較強的抗氧化能力，是一種理想的天然抗氧化劑。