陳明珠，洪佳寶

（武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山354300）

廣西金秀大瑤山甜茶（Rubus Suavissimus S.Lee）是薔薇科懸鉤子屬植物。廣西甜茶含最具有價值的黃酮類物質(zhì)、茶多酚和甜茶素等[1-2]，甜茶無毒害作用，具有降血糖、降低膽固醇、抗氧化、抗腫瘤、抗炎[3]、咳祛痰、潤肺等藥理功效。

甜茶素（rubusoside）易溶于水、甲醇、乙醇等常用溶劑[4]。甜茶素?zé)崃繛檎崽?%，甜度是蔗糖的300 倍[5]。甜茶素具降血糖、降血脂、抗癌[6]、抗齲[7-8]等功效，是理想的食品代糖，用于食品、醫(yī)藥保健、飲料工業(yè)等行業(yè)[9]，具有廣闊的應(yīng)用前景。

茶多酚（tea polyphenols）又稱茶單寧或茶鞣，是甜茶葉主要活性成分之一。茶多酚具有抗氧化、降低膽固醇、抑制血糖上升、抗疲勞、抑制心血管疾病、防癌、清除自由基、減肥、改善人體免疫力、預(yù)防口腔疾病、抑菌、防輻射、抗過敏等作用[10-16]。茶多酚具有較高的營養(yǎng)和保健價值，具有很廣闊的應(yīng)用市場，已經(jīng)遍及食品、服裝、日用品等各個領(lǐng)域。因此茶多酚的提取研究意義重大。其中熱水提取法是應(yīng)用最廣泛的方法之一。

“金花菌”主要是一種冠突散囊菌（Eurotium cristatum），為優(yōu)勢微生物。金花菌具有降脂、減肥、抗氧化、抗癌、抑菌、改善人體腸道、促進消化的功效[17-22]，并無毒副作用。金花菌在發(fā)酵過程產(chǎn)生多種酶類，會將原料中的蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉、果膠質(zhì)等物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化，從而提高原料茶的品質(zhì)，使金花菌發(fā)酵的茶葉具有獨特的色、香、味。

因此近幾年將金花菌接種到各類茶進行發(fā)酵的研究已經(jīng)成為熱點。金花菌除了常用于茯磚茶、六堡茶等黑茶的發(fā)酵之外，其他類茶也可接種[23]。虞飛等[24]對金花菌發(fā)花的不同紅茶和綠茶的感官品質(zhì)進行研究。劉菲等[25]對人工接種金花菌的白茶滋味物質(zhì)的變化進行研究。而且還可以對一些特殊的植物進行接種發(fā)酵并對發(fā)花工藝、發(fā)花過程中品質(zhì)、化學(xué)成分變化進行研究，比如藤茶、杜仲茶和銀杏等[26-30]。金花菌不僅可以接種于磚茶，還可以散茶接種發(fā)酵[31]。金花菌不僅可以在固態(tài)茶葉進行接種發(fā)酵，也可以進行茶葉接種的液態(tài)發(fā)酵[32]。而且還對不同嫩度的鮮茶葉的接種發(fā)酵進行研究。徐小云等[33]對不同嫩度茶樹鮮葉，如一芽一二葉、一芽三四葉和一芽五六葉3 種茶樹鮮葉發(fā)酵的金花散茶理化成分的變化進行研究，得出以一芽三四葉最佳。還可以利用不同階段茶葉，比如夏秋茶進行金花發(fā)酵，變廢為寶[34]。

但是前人并沒有廣西大瑤山甜茶進行金花菌發(fā)酵的研究，而且只停留在植物接種金花菌的接種條件、制作工藝、發(fā)花過程品質(zhì)及化學(xué)成分變化的研究，無金花菌接種植物的產(chǎn)品浸提條件的研究。本研究利用廣西金秀大瑤山甜茶進行金花菌接種干鮮葉散茶發(fā)酵（不經(jīng)過渥堆），并對此發(fā)酵的甜茶進行熱水浸提條件的研究。通過研究熱水浸提時間、料水比及浸提溫度對金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率的影響，以此確定最佳浸提條件，為金花甜茶開發(fā)成為飲料或口服液提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

金花甜茶：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵制作；甜茶：廣西大瑤山；甜茶素標品（純度＞98%，色譜純）：上海源葉生物有限公司；茶多酚標品（≥99%，分析純）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（分析純）：上海展云化工有限公司；水系和有機系膜：天津津騰儀器設(shè)備有限公司；甲醇（色譜純）：美國默克有限公司。

循環(huán)水式多用真空泵（HSZ-D（III））：予華儀器有限公司；電子天平（CPA223S）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；液相色譜儀（Agilent 1260）：美國安捷倫科技公司；皇代粉碎機（430）：浙江金華鉑歐五金廠；紫外可見分光光度計（UVmini-1240 型）：島津公司（日本）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4CW）：鴻科儀器廠；數(shù)控超聲波清機（KQ5200DE 型）：昆州市超聲儀器有限公；高速離心機（HC-2517）：中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金花甜茶水提液的制備

精確稱取3 份1 g 甜茶（40 目篩）粉末于150 mL錐形瓶中，加入若干體積的純水，封口置于一定溫度下熱水浸提，期間晃動3 次，迅速抽濾得濾液，收集金花甜茶水提液。

1.2.2 甜茶素的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定方法

1.2.2.1 色譜條件

選擇甲醇-水作為流動相，210 nm 為檢測波長。色譜柱：Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器：Aglient 1260；柱溫：20 ℃；色譜甲醇和水的體積比為 80 ∶20；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。首次使用，經(jīng)過測試液測定得理論塔板數(shù)大于20 000，平時測定過程不低于9 000。

1.2.2.2 色譜條件標準溶液的配制

色譜條件標準溶液的配制流程如圖1 所示。

圖1 甜茶素標準溶液的配制流程Fig.1 The preparing process of the standard solution of rubusoside

1.2.2.3 含量測定

1.2.3 金花甜茶多酚的測定

1.2.3.1 標準溶液配制

茶多酚標準溶液配制流程如圖3 所示。

1.2.3.2 含量測定

茶多酚含量按照QB/T 4068-2010《食品工業(yè)用茶濃縮液》酒石酸亞鐵比色法進行測定。

圖2 金花甜茶浸提液甜茶素的HPLC 色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram of the Eurotium cristatum sweet tea rubusoside

圖3 茶多酚標準溶液的配制流程Fig.3 The preparing process of the standard solution of tea polyphenol

1.3 試驗方法

1.3.1 金花甜茶甜茶素和茶多酚的浸提路線

金花甜茶→粉碎過篩（40 目）→熱水浸提→過濾→茶多酚待測水提取液→離心→取上清液加入甲醇→甜茶素待測甲醇水溶液。

人工栽培的黃芩品質(zhì)受栽培區(qū)域生態(tài)因子及田間管理影響較大，如山東莒縣所產(chǎn)黃芩中黃芩苷含量顯著高于甘肅產(chǎn)黃芩[4]。生產(chǎn)過程中，由于各地生態(tài)因子及田間管理差異，出現(xiàn)了施肥種類差異大、中耕除草難以規(guī)范以及農(nóng)藥不合理使用等現(xiàn)象[5]，部分產(chǎn)區(qū)連作加重了黃芩根腐病的發(fā)生幾率[6]，農(nóng)殘重金屬超標越發(fā)嚴重，以上因素單一或綜合限制了黃芩藥材的產(chǎn)量及品質(zhì)，造成市售黃芩藥材質(zhì)量不一，影響藥材藥效，同時也影響臨床用藥安全和黃芩的市場競爭力。中藥無公害栽培體系尚不完善[7]，現(xiàn)階段開展黃芩無公害栽培技術(shù)研究具有迫切性。

1.3.2 單因素試驗

取 1 g 的金花甜茶粉末，按照料液比 1 ∶60（g/mL）加入純水，在溫度85 ℃下，浸提時間分別為 15、30、45、60、75、90、105、120、135 min，研究浸提時間對金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率的影響。每個試驗重復(fù)3 次求平均值。

取1 g 的金花甜茶粉末，按照料液比分別為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）加入純水，在浸提溫度85 ℃下，浸提45 min，研究料液比對金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率的影響。每個試驗重復(fù)3 次求平均值。

取 1 g 的金花甜茶粉末，按照料液比 1 ∶60（g/mL）加入純水，在浸提時間為45 min 下，浸提溫度分別為35、45、55、65、75、85、95 ℃，研究浸提溫度對金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率的影響。每個試驗重復(fù)3 次求平均值。

1.3.3 正交試驗

在單因素基礎(chǔ)上，以金花甜茶浸提時間（A）、料液比（B）、浸提溫度（C）3 個因素，做L9（33）正交試驗，對甜茶素和茶多酚浸提率影響進行研究。每個試驗重復(fù)3 次求平均值。試驗因素水平表如表1 所示。

表1 正交試驗的因素水平表Table 1 Factor level of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 浸提時間對金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率的影響

浸提時間對金花甜茶甜茶素浸提率的影響見圖4。

由圖4 可知，甜茶素隨著浸提時間的延長呈先升高后稍微降低的趨勢，在45 min 時達到最高。說明甜茶素在較短時間內(nèi)傳質(zhì)過程就達到平衡。

圖4 浸提時間對金花甜茶甜茶素浸提率影響Fig.4 The effect of the extracting time on the extracting rate of the Eurotium cristatum sweet tea rubusoside

浸提時間對金花甜茶多酚浸提率的影響見圖5。

圖5 浸提時間對金花甜茶多酚浸提率影響Fig.5 The effect of the extracting time on the extracting rate of the Eurotium cristatum sweet tea polyphenol

由圖5 可以看出，在15 min～60 min 之間茶多酚浸提率呈先增長后降低的趨勢，45 min 時達到較高水平，茶多酚浸提率為12.25%，為最高值的98.3%；60 min～135 min 茶多酚浸提率也呈先增長后降低的趨勢，75 min 時茶多酚浸提率達到最高?？赡苁窃谳^長時間高溫作用下，茶多酚發(fā)生氧化、水解等作用，使浸提率下降。綜合考慮浸提時間對甜茶素和茶多酚的影響，確定最佳浸提時間為45 min。

2.1.2 料液比對金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率的影響

料液比對金花甜茶甜茶素浸提率的影響見圖6。

圖6 料液比對金花甜茶甜茶素浸提率影響Fig.6 The effect of solid-liquid ratior on the extracting rate of the Eurotium cristatum sweet tea rubusoside

料液比對金花甜茶多酚浸提率的影響見圖7。

圖7 料液比對金花甜茶多酚浸提率影響Fig.7 The effect of solid-liquid ratior on the extracting rate of the Eurotium cristatum sweet tea polyphenol

由圖6 和圖7 可以得出，隨著溶劑體積的增加，金花甜茶的甜茶素和茶多酚浸提率呈逐漸增加的趨勢，直到1 ∶60（g/mL）后維持平穩(wěn)。這可能是因為溶劑體積較小時，浸提濃度很快達到平衡，抑制甜茶素和茶多酚的繼續(xù)溶出；隨著溶劑體積增大，物料內(nèi)、外溶液的濃度差增大，促進甜茶素和茶多酚溶出。1 ∶70（g/mL）時金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率增加不明顯。因為當溶劑體積增加到一定值時，金花甜茶的甜茶素和茶多酚基本溶出，即使繼續(xù)增大溶劑體積，甜茶素和茶多酚浸提率增加很小。隨著溶劑體積的增加，成本增加。綜合考慮，確定最佳料液比為1 ∶60（g/mL）。

2.1.3 浸提溫度對金花甜茶甜茶素和茶多酚浸提率的影響

浸提溫度對金花甜茶甜茶素浸提率的影響見圖8。

圖8 浸提溫度對金花甜茶甜茶素浸提率影響Fig.8 The effect of the extracting temperature on the extracting rate of the Eurotium cristatum sweet tea rubusoside

由圖8 可以看出隨著溫度的增高，金花甜茶的甜茶素浸提率呈增大的趨勢，75 ℃達到最高后保持穩(wěn)定。

浸提溫度對金花甜茶多酚浸提率的影響見圖9。

由圖9 可以看出，隨著浸提溫度逐漸增高，茶多酚的浸提率逐漸增加，95 ℃達到最大。這可能是因為升高溫度使分子運動加劇，促進了擴散作用，甜茶素和茶多酚的溶解度增加；當溫度升高到某個值時，金花甜茶內(nèi)、外溶液的甜茶素濃度達到平衡，擴散作用達到動態(tài)平衡。因為過高的溫度會導(dǎo)致茶多酚的降解，因此確定最佳浸提溫度為85 ℃。

圖9 浸提溫度對金花甜茶多酚浸提率影響Fig.9 The effect of the extracting temperature on the extracting rate of the Eurotium cristatum sweet tea polyphenol

2.2 正交試驗結(jié)果

金花甜茶甜茶素浸提率正交試驗結(jié)果見表2。

表2 甜茶素浸提率正交試驗結(jié)果分析表Table 2 The result and analysis table of orthogonal experiment on the extracting rate of rubusoside

根據(jù)表2 的正交試驗極差分析可知，影響金花甜茶甜茶素的各因素的主次順序為：料液比＞浸提時間＞浸提溫度。經(jīng)過正交試驗極差分析得出最優(yōu)配方組合，即A3B3C2。而正交試驗浸提率最高的組合也為A3B3C2。因此正交確定的最佳組合為A3B3C2。

金花甜茶多酚浸提率正交試驗結(jié)果見表3。

表3 茶多酚浸提率正交試驗結(jié)果分析表Table 3 The result and analysis table of orthogonal experiment on the extracting rate of tea polyphenol

續(xù)表3 茶多酚浸提率正交試驗結(jié)果分析表Continue table 3 The result and analysis table of orthogonal experiment on the extracting rate of tea polyphenol

由表3 可以看出，影響金花甜茶茶多酚的各種因素的主次順序為：料液比＞浸提溫度＞浸提時間。經(jīng)過正交試驗極差分析已得出最優(yōu)配方組合，即A2B3C2組合。而正交試驗組浸提率最高的因素組合為A3B3C2。通過驗證性試驗可得，A3B3C2茶多酚浸提率為13.7%，而A2B3C2茶多酚浸提率為13.42%，A3B3C2茶多酚浸提率高于A2B3C2。綜合考慮，可以得出正交結(jié)果A3B3C2最佳，即浸提時間為 60 min，料液比為 1 ∶70（g/mL），浸提溫度為85 ℃最佳。

3 結(jié)論與討論

本研究可得最佳浸提條件為：浸提時間是60 min，料液比是1 ∶70（g/mL），浸提溫度是85℃。與向鋒等[35]對甜茶中甜茶素和茶多酚浸提條件的研究得出的結(jié)果不同，可能是金花菌接種甜茶發(fā)酵過程中金花菌分泌的胞外酶的作用使甜茶的理化性質(zhì)和化學(xué)成分發(fā)生變化，而這個過程有待深入研究。金花甜茶適合制作成飲料，故金花甜茶茶湯澄清、穩(wěn)定性和貨架期的預(yù)測等就成為進一步研究的重點。