王洪發(fā) ， 包海鷹 ， 張 亮

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林長春 130118；2.吉林郭爾羅斯生物飼料有限公司，吉林松原138000）

隨著人們生活水平的逐漸提高，人們對肉的品質(zhì)追求也越來越高。然而，抗生素殘留等問題，讓人們意識到傳統(tǒng)抗生素型飼料添加劑正不斷危害著人類身體健康，加上各國逐漸開始限制抗生素的使用，增加了綠色型飼料添加劑開發(fā)的必要性。復(fù)方飼料添加劑是代替抗生素型添加劑的選擇之一，一方面其原材料生長于自然，開發(fā)資源廣闊（劉瀾，2014），無污染、機體殘留極少、不易產(chǎn)生抗藥性（張亮，2017），對于改善動物腸道環(huán)境，增強機體免疫以及改良動物制品質(zhì)量都有顯著的影響（Mendel，2017；Jouany，2007）。 另一方面，由于人們對牛肉的品質(zhì)和需求量不斷提高 （趙成堅，2016），如何提高牛肉產(chǎn)量，提供優(yōu)質(zhì)的牛肉（馮來順，2018），同時也提高牧民經(jīng)濟成為首要解決的問題。本文以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，以硬毛粗蓋孔菌固體發(fā)酵物為主藥配制復(fù)方飼料添加劑，研究其對牛的生長發(fā)育、血液生化指標(biāo)及免疫功能的影響，旨在為硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑在牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗動物由吉林郭爾羅斯生物飼料有限公司提供，為健康的12月齡、生長發(fā)育良好、體重在480 kg左右的西門塔爾公牛20頭。

1.2 試驗材料 硬毛粗蓋孔菌固體發(fā)酵物由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用菌物資源及開發(fā)利用重點研究室發(fā)酵獲得；黃芪、甘草均采購于長春市宏檢大藥房。

1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；無菌超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；生化培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；80-2臺式離心機（天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠）；電冰箱（青島海爾股份有限公司）；地磅；血液生化分析儀（希森美康醫(yī)用電子有限公司）

1.4 日糧配方及成本 精料按照我國牲畜飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，選用本地常規(guī)的原料進行配制，精料具體配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 日糧精料組成及營養(yǎng)水平

1.5 試驗方法

1.5.1 硬毛粗蓋孔菌的固體發(fā)酵 菌種鑒定：取干凈硬毛粗蓋孔菌子實體，75%酒精擦拭表面，在無菌操作臺中紫外滅菌30 min，采用新型植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，以ITS1和ITS4為引物，PCR擴增儀進行擴增，將擴增產(chǎn)物以Marker上樣，20 min后停止電泳，有白亮色條帶。后送至吉林省庫美生物科技有限公司進行檢測，利用GenBank BLAST進行比對，鑒定結(jié)果其 DNA序列與 F.trogii（Berk.）Bondartsev&Singer的相似度達到99%，確定為硬毛粗蓋孔菌子實體。

菌種擴繁：采用上述方法取硬毛粗蓋孔菌子實體，接種在GPY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)皿中長滿白色菌絲。在培養(yǎng)皿中用直徑1 cm的打孔器取下一小塊接種在液體培養(yǎng)基中液體搖床培養(yǎng)7 d后，長滿大小不同的白色菌球。

固體發(fā)酵：選用廢棄的秸稈和楊樹枝（1：1），料液比（2：5），滅菌后將上述培養(yǎng)的白色菌球接種到菌袋中，進行硬毛粗蓋孔菌的固體發(fā)酵，經(jīng)28 d左右可獲得硬毛粗蓋孔菌固體發(fā)酵物，曬干備用。

1.5.2 藥材處理 制備：將干燥后的固體發(fā)酵物、甘草、黃芪分別用粉碎機粉碎，過4 mm篩，備用。拌料：取干燥的發(fā)酵物粉末，將甘草與黃芪按比例攪拌，混勻。出料：將拌好的原材料置于55℃烘干。用紫外線照射殺菌，裝袋，抽氣封口。置于干燥低溫，避光保存。

1.5.3 試驗前處理 試驗前對牛、圈舍、場地進行全面的消毒。采用圈舍飼養(yǎng)，自由飲水，早晚2次（6：0和16：00）飼喂。每頭牛按照2.5 kg的精料飼喂，預(yù)飼期3 d，試驗期30 d。

1.5.4 稱重及血液的采集 A組為空白組，B、C、D組分別按照精料量的1%、3%、5%進行飼喂。在試驗開始和結(jié)束時于晨飼前對所有試驗牛進行空腹稱重，詳細記錄體重。所有試驗牛的平均末重減掉平均初重，即為平均增重，再除以30 d即為平均日增重。在試驗結(jié)束當(dāng)日，用一次性采血管于頸靜脈進行采血，血液樣品離心后，采用血液生化分析儀進行生化指標(biāo)測定并用試劑盒進行免疫指標(biāo)檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Graph-Pad Prism 5進行制圖，用SPSS 23軟件進行統(tǒng)計與分析處理，采用LDS法進行組間的顯著性檢驗，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 西門塔爾公牛體重 由表2可知，各組牛平均初重差異不顯著（P＞0.05）；經(jīng)過30 d的試驗，在平均末重中C組較A組、B組和D組分別提高1.97%、1.24%和0.78%（P＜0.05），而A組、B組和D 組之間無顯著差異（P＞0.05）。 B、C、D 組平均增重分別比A組提高20.1%、52.97%和29.4%（P＜0.01）， 且 B、C、D三組之間差異極顯著 （P＜0.01）。由此可見，精料中添加硬毛粗蓋孔菌添加劑能顯著增加牛的體重，以3%的添加比例增重效果最明顯。

2.2 血液生化指標(biāo)分析 由表3可知，B、C、D組的尿素 （UREA）含量分別較A組降低10.39%、11.35%和10.96%（P＜0.05），但三個組之間無明顯差異。膽固醇 （TCHE）中C、D組較A組降低6.63%和 6.31%（P ＜ 0.05），B 組與 A、C、D 組均無顯著性差異 （P＞0.05），C組低于D組，D組低于B組。血糖（GLUC）中，與A組相比，C、D組分別升高了 8.39%和 7.04%（P ＜ 0.05），B 組與 A、C、D組均無顯著性差異（P＞0.05）。C組高于D組，D組高于B組。甘油三酯（TG）指標(biāo)中，C組較A組降低了18.6%（P＜0.05），其余各組間無顯著性差異（P ＞ 0.05）。 總蛋白（TP）中，與 A 組相比，D 組升高了 5.35%（P＜0.05），B、C 組均有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 免疫參數(shù)分析 由圖1可知，IgA、IL-2、IL-4三個免疫指標(biāo)中，C組較A組分別提高了27.99%、39.02%和37.63%（P＜0.05），但與其他組無顯著性差異（P＞0.05），A組與B、D兩組間的差異不顯著（P＞0.05），B組與D組差異也不顯著 （P＞0.05）。C、D兩組 IgG較 A組分別提高了 21.06%和15.64%（P＜0.01），C組較B組提高了 11.42%（P＜0.05），而C組與D組無顯著性差異（P＞0.05）。與A組相比，除D組IFN-γ提高了15.58% （P＜0.05）外，B 組、C 組均無顯著差異（P ＞ 0.05），B、C、D三個組之間也無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑對牛體重的影響眾所周知，抗生素的弊病已日益明顯，動物食品中藥物殘留和耐藥性等問題嚴(yán)重影響到食品安全和公共衛(wèi)生安全（張中橋，2018），急需一種新的抗生素替代品。而菌物類飼料添加劑具有純天然性、多功能性、來源廣泛、有害殘留少、毒副作用小、幾乎對環(huán)境沒有污染和具有防霉防腐敗作用等優(yōu)點，并且能全面調(diào)節(jié)機體的生理功能，在復(fù)方飼料添加劑領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力（李玉娟，2015）。本試驗結(jié)果表明，飼喂3%硬毛粗蓋孔菌復(fù)方飼料添加劑的試驗牛平均增重和平均日增重分別達到了43.08 kg，1435.87 g/d。日增重比空白組增長了52.97%，飼料轉(zhuǎn)化率比空白組提高了34.59%。可能一方面是由于甘草具有補脾益氣，清熱解毒，調(diào)和諸藥之功（郭爭爭，2015）；黃芪具有增強機體免疫功能、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用（尚麗君，2019）。另一方面是硬毛粗蓋孔菌能夠改善動物機體免疫機能，對纖維素具有良好的降解能力，刺激牛、羊等反芻動物的胃腸，幫助消化吸收，從而提高牛的體重。

3.2 硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑對牛血液生化指標(biāo)的影響 血清生化指標(biāo)不僅能夠反映機體健康與否和生長速度快慢，更能有效的檢測出機體免疫因子和新陳代謝是否正常（姜賀，2015）。本試驗中，血糖及總蛋白的含量和空白組相比都有較大的升高趨勢，而尿素、膽固醇和甘油三酯則是降低趨勢。這說明了該添加劑使機體合成代謝得到加強，可為動物提供充足的能量，增強免疫力，使其健壯的生長。同時降低膽固醇和甘油三酯，表明復(fù)方添加劑可以改善肝功能，機體中脂類合成處于平衡狀態(tài)，降低了肝臟疾病的發(fā)生。

3.3 硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑對牛免疫指標(biāo)的影響 細胞因子是由免疫細胞或某些非免疫細胞經(jīng)過刺激誘導(dǎo)合成和分泌的一類有生物活性的小分子多肽。細胞因子可參與免疫細胞的分化發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、刺激造血以及促進組織修復(fù)等（孟祥樂，2017；魏靜，2016）。本試驗中與空白組相比：B 組 IgA、IgG、IFN-γ、IL-2、IL-4的含量均有升高，但差異不顯著（P＞0.05）。C組IgA、IL-2、IL-4 的含量顯著升高 （P ＜ 0.05），IgG的含量則極顯著升高（P＜0.01），而IFN-γ的含量沒有顯著性差異（P ＞ 0.05）。D 組 IgA、IL-2、IL-4的含量均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但IFN-γ、IgG的含量分別為顯著性（P＜0.05）和極顯著性（P＜0.01）升高。從上述可知，硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑可以提高肉牛的免疫球蛋白、干擾素以及白介素的含量，其機制可能是菌物與中草藥之間相互配伍，可調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，分泌免疫活性物質(zhì)，使其增殖分化，從而提高肉牛的免疫功能。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，不同劑量硬毛粗蓋孔菌飼料添加劑組牛的體重及免疫功能均有增高的趨勢，尤其是3%劑量組效果顯著，不僅可以降低尿素和膽固醇以及甘油三酯的含量，而且還能使I-gA、IgG、IL-2、IL-4的含量顯著增高。 因此，在使用該飼料添加劑時比例不宜過高，添加量應(yīng)控制在3%左右為宜。