桑 鵬 ，劉林波 ， 陳貴元 ，楊力權(quán) *

（1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

脂肪酶全稱為?；视退饷福瑥V泛分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，其中以微生物類脂肪酶居多。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)脂肪酶的微生物有：熒光假單胞菌、黑曲霉菌、根霉菌、毛霉圓柱假絲酵母菌、圓弧青霉粘質(zhì)色桿菌和枯草桿菌（陳雄金等，2008）。脂肪酶可以催化脂水解、酯交換、酯合成等反應(yīng)，因而在食品、化妝品、皮革、生物柴油等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用。

耐熱脂肪酶和普通脂肪酶相比具有耐高溫的特點(diǎn)。耐熱脂肪酶主要分離自一些特殊環(huán)境中的微生物，例如熱泉、深海熱液、廢水處理廠等特殊環(huán)境微生物。在商業(yè)上也因其在高溫下具有較高的反應(yīng)效率，可以減少微生物污染的可能性，降低反應(yīng)溶液的黏度，提高底物的溶解度等特點(diǎn)，而受到越來(lái)越多的重視，并且已經(jīng)有很多耐熱脂肪酶被純化、克隆和進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究，被廣泛應(yīng)用于洗滌劑和生活污水等方面（劉秀萌等，2016）。因此，篩選產(chǎn)高溫脂肪酶的菌株成為了一項(xiàng)重要的工作。本試驗(yàn)以大理彌渡熱泉底泥為材料，篩選出能產(chǎn)耐高溫脂肪酶的菌株，并對(duì)其分類鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究，為脂肪酶的發(fā)酵工業(yè)新備選菌株的開發(fā)應(yīng)用提供資源，為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株提供基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步獲得產(chǎn)脂肪酶基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品來(lái)自大理彌渡縣石夾泉熱泉的底泥，熱泉水溫43℃。

1.1.2 主要儀器 顯微鏡（奧林巴斯），紫外可見光分光光度計(jì)（上海菁華儀器公司），高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），水浴恒溫?fù)u床（常州國(guó)華電器有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI），電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑 酵母抽提物、蛋白胨為英國(guó)進(jìn)口；瓊脂粉為西班牙進(jìn)口分裝；三丁酸甘油酯、氯化鈉、結(jié)晶紫、碘、乙醇、孔雀綠、番紅均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；DNA抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、膠回收試劑盒和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L；自然pH。

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，三丁酸甘油酯2 ml/L，瓊脂粉20 g/L；自然pH。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5 g，蛋白胨10 g，K2HPO40.5 g，硫酸銨 0.5 g，硫酸鎂 0.25 g，橄欖油5 mL，加蒸餾水定容至500 mL，自然pH。上述培養(yǎng)基均在121℃，0.1 MPa下滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株富集 稱取石夾泉熱泉底泥2 g于45 mL的無(wú)菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩15 min。在無(wú)菌條件下，用移液槍吸取5 mL懸液于50 mL的富集培養(yǎng)基中，將接種好的富集培養(yǎng)基置于43℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株初篩 將富集好的菌液稀釋至10-3、10-6、10-9倍，用移液槍分別吸取稀釋的菌液150μL接種在篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。于37℃，倒置培養(yǎng)24 h。菌落周圍如果有透明圈出現(xiàn)，說明該菌株能產(chǎn)生脂肪酶。

1.2.3 菌株復(fù)篩 將初篩得到的菌株取少量接種于種子瓶 （LB液體培養(yǎng)基），43℃培養(yǎng)24 h后，將種子液按2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，43℃，150 r/min水浴搖床培養(yǎng)一周。離心取上清測(cè)酶活性。

酶活性測(cè)定：參照江慧芳等（2007）的方法進(jìn)行。配制對(duì)硝基苯棕櫚酸酯（p-NPP）底物溶液10 mmol/L和對(duì)硝基苯酚（p-NP）標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mmol/L：將p-NP標(biāo)準(zhǔn)溶液用1 mol/L的碳酸鈉溶液稀釋成 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L 10個(gè)梯度，分別取1 mL，再分別加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL和0.5 mol/L的NaOH 3 mL，混勻后410 nm處測(cè)定吸光度，繪制對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取20μL p-NPP底物溶液，加入780μL Tris-HCl緩沖液，37℃預(yù)熱5 min后加入200μL酶液，反應(yīng)10 min后加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL，混勻后放置5 min終止反應(yīng)，再加入0.5 mol/L的NaOH 3 mL調(diào)pH，（將200μL蒸餾水替換200μL酶液，其他條件不變，即得空白），于410 nm處測(cè)定吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出生成的p-NP濃度，進(jìn)而計(jì)算出酶活力。

酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1μmoL對(duì)硝基苯酚的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

計(jì)算公式：X=c V/t V'；

式中：X為脂肪酶活力，U/mL；c為對(duì)硝基苯酚濃度，μmol/L；V為酸堿調(diào)節(jié)后的反應(yīng)液終體積，mL；V'為酶液的用量，mL；t為作用時(shí)間，min。1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 產(chǎn)酶菌株的形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)參照黃秀梨等（2008）的方法進(jìn)行。

1.2.4.2 16SrRNA基因序列測(cè)序和分析 根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進(jìn)行DNA的提取。使用通用引物 27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和 1492R:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，擴(kuò)增細(xì)菌 16SrDNA。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火 50 ℃，45 s；延伸 72 ℃，100 s，最后延伸72℃，5 min，循環(huán)30次，將PCR產(chǎn)物加入預(yù)先制備好的0.8%的瓊脂糖凝膠中，140 V，電泳1 h，瓊脂糖凝膠回收根據(jù)北天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。將PCR回收產(chǎn)物送廣州英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，將獲得的序列提交GenBank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov），根據(jù)BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌16SrRNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.5 菌株最適生長(zhǎng)溫度 按接種量為1%的菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于不同的溫度（25、31、37、43、49、55 ℃）下?lián)u床培養(yǎng) 24 h，然后在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定各個(gè)溫度下菌株生長(zhǎng)的吸光值，以確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

1.2.6.1 溫度對(duì)酶活力的影響 將酶液分別在4～75℃條件下測(cè)定脂肪酶的活力。

1.2.6.2 pH對(duì)酶活力的影響 在最適酶活力溫度下，配制不同pH的反應(yīng)緩沖液，檢測(cè)不同的pH對(duì)脂肪酶活力的影響。

1.2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性 將1 mL酶液分別置于不同的溫度（4、25、37、55、75 ℃）下保溫，保溫一定時(shí)間后測(cè)定酶活力，以保溫0 min溫度下所測(cè)得的酶活力為對(duì)照組，其余溫度下所測(cè)得的酶活力與其相比并計(jì)算相對(duì)酶活力，用相對(duì)酶活力繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.4 金屬離子對(duì)酶活力的影響 將1 mL的酶液和10μL濃度為0.1 mol/L的金屬離子（Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+）混勻，將其放置到4℃冰箱過夜，第二天測(cè)定各組酶活力。以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對(duì)照組，測(cè)定和觀察金屬離子對(duì)酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選 根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值的大小，篩選出3株產(chǎn)高溫脂肪酶菌株，其中1號(hào)菌株水解圈直徑與菌落直徑比值（R1/R2）最大。經(jīng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)3株菌均為分泌型脂肪酶產(chǎn)生菌，且1號(hào)菌株酶活最高，達(dá)到106.5 U/mL，與初篩的結(jié)果相符。因此，選擇1號(hào)菌株作為后續(xù)試驗(yàn)研究菌株，命名為L(zhǎng)ip-43。

2.2 菌種鑒定

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 Lip-43在LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)72 h后，菌落呈乳白色，不透明，圓形隆起，黏稠，不易挑取。革蘭氏染色為陰性，菌體呈球桿狀，無(wú)芽孢。

對(duì)Lip-43的生理生化特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)結(jié)果均為弱陽(yáng)性；吲哚試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；乳糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果為陰性；葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果均為能利用糖，但不產(chǎn)氣。

2.2.2 16SrRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rRNA基因測(cè)序，所獲得的序列長(zhǎng)度為1440 bp，將Lip-43的16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Lip-43與不動(dòng)桿菌屬的16SrRNA基因序列自然聚類，Lip-43的16SrRNA基因序列與13條相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），從圖中可以看出Lip-43與Acinetobacter sp.Acinetobacterbaumannii的菌株聚為一群，相似性也最高，表明Lip-43與Acinetobacter sp.的親緣關(guān)系最近。

根據(jù)Lip-43的形態(tài)及生理生化特征，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）（布坎南等，1984），以及Lip-43 16SrRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹，將Lip-43初步鑒定為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）的一株菌，命名為Acinetobacter sp.Lip-43。

2.3 菌種的最適生長(zhǎng)溫度 按照試驗(yàn)方法，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定不同溫度培養(yǎng)下LB培養(yǎng)基的吸光值，以600 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度—吸光值關(guān)系曲線，結(jié)果如圖4。

從圖4中可知，溫度為25～37℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而增加，37℃時(shí)，LB培養(yǎng)基在600 nm下的吸光值最高，表明37℃是菌株的最適生長(zhǎng)溫度。37℃以后，菌體生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而下降，菌株在55℃下菌體還有一定生長(zhǎng)，菌株屬于典型的耐高溫菌。

2.4 菌株Lip-43的脂肪酶性質(zhì)

2.4.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)制作對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，制作出的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=0.0036X+0.0006，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9905，表明線性比較好。

2.4.2 溫度對(duì)酶活的影響 按照試驗(yàn)方法，在不同溫度下測(cè)定酶的活性，以酶活力為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度—酶活關(guān)系曲線（圖5）。

從圖5可以看出，低溫能抑制酶的活性，但不能使酶失活，在4℃的條件下，脂肪酶仍具有活性，但活性較低，4～75℃，隨著溫度升高，酶活力增加，在45℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為106.5 U/mL，在45℃之后，隨著溫度升高，脂肪酶活力反而降低，部分酶失去活性。酶反應(yīng)都有一個(gè)最適反應(yīng)溫度，在沒有達(dá)到最適反應(yīng)溫度之前，酶活力隨著溫度升高而增加，超過最適反應(yīng)溫度，酶開始失活，反應(yīng)速度降低，45℃是脂肪酶的最適反應(yīng)溫度，菌株產(chǎn)生的脂肪酶屬于典型的耐熱脂肪酶。

2.4.3 脂肪酶的最適反應(yīng)pH 從圖6可以看出，pH 5.0之前，脂肪酶活力隨著pH的升高而升高，在pH 5.0之后，脂肪酶活力下降且下降速度較快，酶促反應(yīng)都有最適pH，當(dāng)反應(yīng)體系pH大于或者小于酶促反應(yīng)的最適pH時(shí)，酶活力相對(duì)于最適酶促反應(yīng)pH條件下的酶活力較低。因此，pH 5.0是該脂肪酶的最適反應(yīng)pH，表明菌株Lip-43產(chǎn)生的脂肪酶屬于酸性脂肪酶。

2.4.4 脂肪酶熱穩(wěn)定性 測(cè)定各個(gè)溫度下不同時(shí)間點(diǎn)脂肪酶的酶活，以保溫0 min溫度下所測(cè)得的酶活為對(duì)照組，其余溫度下所測(cè)得的酶活與其相比并計(jì)算相對(duì)酶活，用相對(duì)酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可以看出，Lip-43脂肪酶在37℃以下能夠在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的酶活，表明該酶可在較低的溫度下保存，酶在75℃保溫120 min，相對(duì)酶活損失近50%，菌株產(chǎn)生的酶雖然是高溫脂肪酶，但酶在較高的溫度下，酶活性隨著保溫的時(shí)間增加而降低，酶的熱穩(wěn)定性較差，溫度耐受性質(zhì)符合一般酶的性質(zhì)。

2.4.5 金屬離子對(duì)酶活的影響 本試驗(yàn)中將加有金屬離子的稀釋酶液在4℃中保溫過夜，以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對(duì)照組，測(cè)定各種金屬離子對(duì)酶活力的影響，結(jié)果見圖8。

從圖8可知，Zn2+和Ca2+對(duì)脂肪酶的活力有一定的抑制作用，其余離子均有一定的促進(jìn)作用，其中Mn2+對(duì)脂肪酶活力的促進(jìn)作用最為明顯，金屬離子可通過與酶的活性中心結(jié)合，影響酶活性。因此，Zn2+和Ca2+與酶的活性基團(tuán)結(jié)合，抑制酶的活性中心與底物結(jié)合，使酶活性降低。其余金屬離子與酶活性中心結(jié)合后，改變了酶活性基團(tuán)的構(gòu)象，使底物與活性中心結(jié)合能力更強(qiáng)，酶活力增加。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從大理彌渡白總旗熱泉篩選到一株能向胞外分泌高溫脂肪酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為不動(dòng)桿菌，命名為Acinetobacter sp.Lip-43。菌株最適生長(zhǎng)溫度為37℃，菌株在55℃仍能生長(zhǎng)。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH為5.0，為酸性脂肪酶。該酶在4、25、37℃下能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，Zn2+和Ca2+對(duì)Lip-43脂肪酶的活力有一定的抑制作用，Mn2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均對(duì)Lip-43脂肪酶活力具有一定的促進(jìn)作用，其中Mn2+的促進(jìn)效果最為明顯。