徐 楨，陳 云，衛(wèi)恒習(xí)，李 莉，孟 立，張守全

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展及種公豬站越來(lái)越廣泛地推廣應(yīng)用，種公豬精液的品質(zhì)對(duì)養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的影響越來(lái)越顯著。種公豬射精量少、精子畸形率高、活力弱等不良精液品質(zhì)表現(xiàn)是導(dǎo)致種公豬繁殖障礙的重要因素。有研究稱，RUVBL2（RuvB-like 2）蛋白在人體睪丸組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他組織，這反映了在精子生成和成熟的過(guò)程中RUVBL2基因可能發(fā)揮著重要作用[1]。RUVBL2 蛋白與多種細(xì)胞的活性相關(guān)，并參與了多種細(xì)胞活動(dòng)的過(guò)程，包括染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)等[2]。有研究證明，RuvB-like 蛋白在復(fù)合物的組裝中起著重要作用，具有分子伴侶的活性[3]。此外，RUVBL2基因特異性地存在于成年小鼠的睪丸和睪丸生精細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，這可能與小鼠精子的成熟或生殖細(xì)胞的分化過(guò)程相關(guān)[4]。但RUVBL2基因在種公豬的精子生成或成熟過(guò)程中的作用機(jī)理尚不清楚。本研究旨在構(gòu)建豬的pIRES2-EGFP-RUVBL2 真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染到CHO 細(xì)胞中，進(jìn)一步觀察豬睪丸組織中的RUVBL2基因能否在CHO 細(xì)胞中表達(dá)，為研究RUVBL2基因在種公豬精子生成和成熟過(guò)程中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 3 頭15 月齡長(zhǎng)白種公豬的睪丸組織、pIRES2-EGFP 質(zhì)粒和CHO 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室所保存；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、凝膠DNA 微量回收試劑盒、細(xì)胞RNA 提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Tiangen 公司；全蛋白提取試劑盒、BAC 蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)股份有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DL2000 DNA Marker、DL 15000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Gibco 公司；兔源RUVB2 抗體（bs-19836R）購(gòu)自Bioss 公司；鼠源β-actin抗體（T0022）購(gòu)自Affinity 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（E030110）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（E030120）購(gòu)自Earthox 公司；DMEM、胎牛血清購(gòu)自Sigma 公司；Western-blot Marker（180 ku）購(gòu)自Fermentas 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中RUVBL2基因全長(zhǎng)序列（NM_001243867.1），用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物：5'-CGGAATTCATGA CAACCGTGACAGCCA-3'（下劃線為EcoRI 酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-AACTGCAGGGAGGTGTCCAT GGTCTCG-3'（下劃線為PstI 酶切位點(diǎn)），預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 392 bp。引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 分別以3 頭長(zhǎng)白種公豬睪丸組織cDNA 為模板，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：2× PCR Mix 酶25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板（2.5 ng/μL）2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性3 min、94℃變性30 s、62℃ 退火30 s、72℃ 延伸90 s 35 個(gè)循環(huán)、72℃徹底延伸10 min。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及目的基因片段回收。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將質(zhì)粒pIRES2-EGFP和膠回收的PCR 產(chǎn)物分別用EcoRI 酶和PstI 酶進(jìn)行雙酶切；之后進(jìn)行16℃ 16 h 目的基因RUVBL2的片段連接，反應(yīng)體系（15 μL）：DNA 片段（45 ng/μL）9.5 μL、載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP（50 ng/μL）3.2 μL、10×Buffer 1.5 μL、T4 DNA 連 接 酶0.8 μL；最 后 將 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，再挑選克隆抽提質(zhì)粒，用雙酶切法進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定并送至生工生物工程股份有限公司（上海）測(cè)序。

1.2.4 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染前一天用0.25%的胰酶消化CHO 細(xì)胞并計(jì)數(shù)，24 孔鋪板時(shí)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000 的說(shuō)明書將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24～48 h 后，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的RT-PCR 使用RNA 提取試劑盒從轉(zhuǎn)染48 h 的貼壁細(xì)胞中提取RNA。反轉(zhuǎn)錄CHO 細(xì)胞的cDNA，第一步反應(yīng)體系（10 μL）：Oligo dT Primer（50 μmol/L）1 μL、dNTP Mix 酶1 μL、模 板RNA（50 ng/μL）5 μL、RNase Free ddH2O 3 μL,65 ℃5 min、冰上迅速冷卻；第二步反應(yīng)體系（20 μL）：上步反應(yīng)液10 μL、5× PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、PrimeScript II RTase 1 μL、RNase Free ddH2O 4.5 μL，42 ℃ 30～60 min、95 ℃ 5 min。CHO 細(xì) 胞cDNA 的 RTPCR 反應(yīng)體系（10 μL）：2× Tap Plus Master Mix 酶5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，CHO 細(xì)胞cDNA（10 ng/μL）1 μL，ddH2O 3 μL，94 ℃預(yù)變性5 min、94℃ 變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min 32 個(gè)循環(huán)、72℃ 徹底延伸7 min 。反應(yīng)完成后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的Western-blot 檢驗(yàn) 將貼壁細(xì)胞從壁上刮下來(lái)，并轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫下2 000 r/min離心10 min，去除濾液，再用PBS 洗細(xì)胞，相同條件下再離心5 min，后再重懸細(xì)胞，再次離心5 min，之后使用全蛋白試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，并用BAC 蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將提取純化的CHO 細(xì)胞蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經(jīng)5% 脫脂奶粉的封閉，之后分別進(jìn)行一抗兔源RUVB2（1:1 000 稀釋）和一抗鼠源β-actin（1:1 000 稀釋）的孵育（搖床上孵育1 h 或者4℃條件下孵育過(guò)夜），孵育完成后先后進(jìn)行10 min/次TBST（2 次）和10 min/次TBS（1 次）的洗膜。洗完膜后，用同樣的方法分別進(jìn)行HRP 標(biāo)記山羊抗鼠二抗（1:4 000 稀釋）和HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1:4 000 稀釋）的孵育及二次洗膜，隨后在曝光儀下進(jìn)行曝光反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1RUVBL2基因的擴(kuò)增與鑒定 分別以3 頭長(zhǎng)白種公豬睪丸組織cDNA 為模板，使用上述引物擴(kuò)增出睪丸RUVBL2目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示，擴(kuò)增片段大小約1 392 bp，與預(yù)計(jì)片段長(zhǎng)度相符。

2.2 重組表達(dá)載體的PCR 鑒定與雙酶切鑒定 同樣用上述引物進(jìn)行重組質(zhì)粒的PCR 鑒定以篩選出陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示其大小約1 392 bp（圖2-A），后利用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和PstI 對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，其結(jié)果（圖2-B）與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 重組表達(dá)載體的測(cè)序鑒定 將重組表達(dá)載體送至生工生物工程股份有限公司（上海）進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果證明RUVBL2基因已正確地插入到了載體pIRES2-EGFP 的多克隆位點(diǎn)，三聯(lián)密碼閱讀框正確。RUVBL2基因序列使用Blast 分析，結(jié)果與原序列吻合度為100%。

2.4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞RUVBL2 融合蛋白的熒光鑒定 將構(gòu)建成功的pIRES2-EGFP-RUVBL2重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到CHO 細(xì)胞后，恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察熒光結(jié)果（圖3），表明pIRES2-EGFP-RUVBL2重組表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)染到了CHO 細(xì)胞中。

2.5 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的RT-PCR 鑒定 以轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)載體CHO 細(xì)胞的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，再用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行β-actin 作為內(nèi)參的瓊脂糖凝膠電泳，其結(jié)果與預(yù)期相符（圖4）。

2.6 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的Western-blot 鑒定 以未轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的CHO 細(xì)胞為對(duì)照、β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行Western-blot 鑒定，轉(zhuǎn)染過(guò)重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-RUVBL2 的CHO 細(xì)胞中有一種相對(duì)分子量約為26 ku 的蛋白，其大小與GFP 蛋白大小相一致（圖6）。

3 討 論

RUVBL2 蛋白是細(xì)菌DNA 解旋酶RUVB 蛋白在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白[5]。RUVBL2基因在調(diào)節(jié)能量代謝、DNA 修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、應(yīng)激適應(yīng)和疾病等過(guò)程起著重要作用[6-8]。有研究表明，小鼠早期胚胎的致死與RUVBL1基因和RUVBL2基因有關(guān)，并且RUVBL1基因和RUVBL2基因在小鼠早期胚胎發(fā)育開始時(shí)起著關(guān)鍵作用[9]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸中RuvB-like 1 蛋白、RUVBL2 蛋白對(duì)體內(nèi)蛋白穩(wěn)定性方面具有獨(dú)特的相互依賴作用[10]。另有報(bào)道，RuvB-like 1 蛋白、RUVBL2 蛋白與Hsp90 可形成R2TP（Ruvbl1-RUVBL2-Tah1-Pih1）復(fù)合物，并且可作為共同伴侶參與多種蛋白復(fù)合物的組裝[11]。韓瀠儀[12]通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將RUVBL2 siRNA 轉(zhuǎn)入到人肺纖維細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)RUVBL2基因的缺失或表達(dá)抑制將會(huì)阻礙DNA 損傷修復(fù)的應(yīng)答進(jìn)程。鄭英等[5]構(gòu)建了人RUVBL2真核表達(dá)載體，并使其能夠在HeLa 細(xì)胞中表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白種公豬的睪丸組織中特異性地存在著RUVBL2基因，這可能與公豬的生殖細(xì)胞分化過(guò)程有關(guān)，RUVBL2基因可能在其中參與DNA 復(fù)制、重組等過(guò)程。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)RUVBL基因的研究多來(lái)自于鼠源和人源，并未發(fā)現(xiàn)有豬源RUVBL2基因的相關(guān)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)并構(gòu)建了豬源RUVBL2真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-RUVBL2，并成功地轉(zhuǎn)入到了CHO 細(xì)胞，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了種公豬睪丸組織中的RUVBL2基因能夠在CHO 細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)種公豬睪丸組織中RUVBL2基因在體外異源細(xì)胞中的表達(dá)有了新的認(rèn)識(shí)，為種公豬體外研究RUVBL2基因?qū)ΨN公豬精子生成和成熟過(guò)程中的作用機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從豬的睪丸組織中克隆出了RUVBL2基因，并構(gòu)建了豬的RUVBL2真核表達(dá)載體pIRES2-EGFPRUVBL2，同時(shí)借助脂質(zhì)體將重組表達(dá)載體成功地轉(zhuǎn)入到了CHO 細(xì)胞，證實(shí)了豬睪丸組織中的RUVBL2基因能夠在CHO 細(xì)胞中表達(dá)。