向 蓉，梁偉杰，袁明貴，彭新宇，余丹妮，徐志宏，康樺華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣東廣州 510640）

目前微生態(tài)制劑已廣泛應(yīng)用，也是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中重要的抗生素替代品。相對于抗生素，微生態(tài)制劑是無殘留、無毒、無污染的安全環(huán)保產(chǎn)品[1-2]。中藥中的天然活性物質(zhì)成分復(fù)雜，傳統(tǒng)的炮制方法難以將藥效發(fā)揮到最佳[3]。近年越來越多的研究表明，利用微生物對中藥或其活性物質(zhì)進行發(fā)酵可以使細胞壁及細胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素等物質(zhì)降解，從而減小細胞壁、細胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴散的傳質(zhì)阻力，可提高有效成分提取率，達到增強藥效或者產(chǎn)生新的藥效的作用[4-6]。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）別名為酪酸菌，是在土壤和10%～20%的健康人糞便中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生丁酸的專性厭氧革蘭氏陽性芽孢桿菌[7]，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（原農(nóng)業(yè)部）已于2009 年批準(zhǔn)丁酸梭菌作為斷奶仔豬和肉仔雞的飼料添加劑，因此探索高效的丁酸梭菌發(fā)酵工藝用以制備高活性的丁酸梭菌制劑具有重要意義。龍眼是國家衛(wèi)生健康委員會官方批準(zhǔn)的“藥食同源”食物之一，龍眼多糖是龍眼肉的主要生物活性成分，具有增強自由基的清除、增強機體免疫力以及促進腸道有益菌增長等諸多生物功能[8]。龍眼是廣東名特稀有水果，其果實深受人們喜愛，但在食用或加工過程中會產(chǎn)生大量龍眼碎肉等邊角料副產(chǎn)品，這些邊角料副產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和活性成分不低于正常果肉，但通常是直接丟棄，既浪費資源，又不利于環(huán)境保護。因此，本試驗旨在研究丁酸梭菌液體發(fā)酵龍眼多糖的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，并探明發(fā)酵液中總多糖含量的變化情況，為生產(chǎn)安全、高效、無殘留的富含多糖的丁酸梭菌微生態(tài)制劑奠定理論基礎(chǔ)，為龍眼加工廢棄物的資源化再利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 丁酸梭菌（GIMCC GIM1.676）購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。龍眼干為廣東省高州市“雞眼”品種經(jīng)干制后加工而成。梭菌增菌培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。纖維素酶（Avicel?PH-101）為Sigma 公司產(chǎn)品；苯酚、濃硫酸為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；無水乙醇為南京化學(xué)試劑股份有限公司生產(chǎn)；無水葡萄糖為上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品；液體石蠟為江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司產(chǎn)品。

主要儀器與設(shè)備包括XS-205DU 十萬分之一天平（廣州三元科技有限公司）、pHS-3C 數(shù)顯pH 計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州奧華儀器有限公司）、RE 5299 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、UV-3100PC 紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）、LRH-150F 生化培養(yǎng)箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）、多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng)（廣州市尤德生物科技有限公司）。

1.2 龍眼多糖的提取 稱取適量龍眼果肉勻漿，參照賀寅等[9]優(yōu)化的酶法工藝條件提取龍眼多糖，即纖維素酶添加量為1.2%（w/w）、液料比為15:1、溫度為45.0℃、時間為187.0 min，在120 r/min 搖床上進行提取試驗。提取結(jié)束后80℃水浴滅酶10 min。用8 層紗布過濾掉龍眼果肉殘渣后將所得液體通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，獲得龍眼多糖提取液。

1.3 龍眼多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[10-11]測定龍眼多糖含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精確地稱量干燥的葡萄糖100.00 mg，用去離子水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，得到1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。用移液槍分別吸取0、100、200、300、400、500、600 μL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）于10 mL容量瓶中定容，搖勻，得到不同濃度（0、10、20、30、40、50、60 μg/mL）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次移取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL 于10 mL 試管中，用移液槍依次加入1.0 mL 預(yù)先配好的6% 苯酚溶液，搖勻，再用移液管依次加入5.0 mL 濃硫酸，蓋上膠塞，搖勻后放入沸水浴中加熱25 min，再放入冷水浴中，直至冷卻至室溫，用紫外分光光度計在490 nm 處測定待測樣品的吸光度。以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、以每個濃度相對應(yīng)的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進行線性擬合后得到線性回歸方程，即標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

龍眼多糖提取物中多糖含量測定采用上述苯酚-硫酸法，測得的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算多糖含量。

1.4 細菌的培養(yǎng)和計數(shù) 菌種活化后，接種于梭菌增菌液體培養(yǎng)基，加入適量的液體石蠟液封后放入生化培養(yǎng)箱中，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h。

活菌計數(shù)采用平板菌落計數(shù)法。將瓊脂粉按2%比例加至梭菌增菌培養(yǎng)基中配置成計數(shù)平板。吸取發(fā)酵液1 mL，經(jīng)10 倍梯度稀釋后，吸取10-4、10-52 個梯度的稀釋液100 μL 進行涂板，平板置厭氧罐中經(jīng)多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng)配置成厭氧環(huán)境，然后將厭氧罐置于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后進行計數(shù)。

1.5 單因素試驗 分別以不同龍眼多糖浸提液添加量、接種量、發(fā)酵時間、初始pH 為單因素條件，采用連續(xù)評估的方法，即對前一個發(fā)酵參數(shù)進行評估，再將其合并在隨后的試驗中進行后一個參數(shù)的評估，采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定各組丁酸梭菌活菌量，并比較同一因素中不同水平組活菌量差異。

1.5.1 不同龍眼多糖浸提液添加量的設(shè)置 在初始條件接種量3%、初始pH 為7.0、發(fā)酵時間14 h 條件下，設(shè)置不同龍眼多糖添加量（5%、10%、20%、30%、40%）進行發(fā)酵。

1.5.2 不同接種量的設(shè)置 采用1.5.1 中測定的最佳龍眼多糖浸提液添加量、初始pH 為7.0、發(fā)酵時間14 h，設(shè)置不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）進行發(fā)酵。

1.5.3 不同發(fā)酵時間的設(shè)置 采用1.5.1 中測定的最佳龍眼多糖浸提液添加量、1.5.2 中的最佳接種量、初始pH為7.0，設(shè)置不同發(fā)酵時間（10、12、14、16、18 h）進行發(fā)酵。

1.5.4 不同初始pH 的設(shè)置 在最佳龍眼多糖浸提液添加量、最佳接種量、最佳發(fā)酵時間條件下，設(shè)置不同初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）進行發(fā)酵。

1.6 正交試驗 本研究選取龍眼多糖添加量（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）和初始pH（D）4 個因素，每個因素設(shè)定3 個水平，以丁酸梭菌的活菌量為指標(biāo)，選擇正交表L9（34）進行正交試驗，并通過極差和方差分析確定丁酸梭菌與龍眼多糖的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。正交試驗表如表1 所示。

表1 正交試驗因素、水平

1.7 工藝驗證試驗 按照優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝，接種丁酸梭菌到500 mL 含龍眼多糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入適量液體石蠟液封，連續(xù)發(fā)酵3 次，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的丁酸梭菌活菌量，檢驗優(yōu)化后的發(fā)酵工藝是否穩(wěn)定。

1.8 發(fā)酵前后多糖含量變化 精確吸取1.7 中發(fā)酵液樣品0.5 mL 加入2 mL 無水乙醇，放入4℃冰箱中靜置2 h。8 000 r/min 離心15 min，去上清，加入10 mL 蒸餾水后于80℃溶解沉淀。吸取2 mL 沉淀溶解液用1.3 中苯酚硫酸法測定多糖含量。測定發(fā)酵前后多糖含量均連測3 次。

1.9 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23 進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，GraphPad Prism 6 作圖。顯著性檢驗為單因素方差分析檢驗，與最優(yōu)組比較顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼多糖含量測定方法的線性關(guān)系 以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、以每個濃度相對應(yīng)的吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進行線性擬合后得到線性回歸方程為y=0.0126x+0.0007，R2=0.999 6。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 不同龍眼多糖添加量對丁酸梭菌生長的影響 在溫度37℃，接種量3%，初始pH 為7.0 條件下發(fā)酵14 h 后，隨著龍眼多糖添加量的增多，丁酸梭菌的活菌量也越來越多（圖2）。當(dāng)龍眼多糖添加量為30%時，丁酸梭菌的活菌量最多，達到1.16×109CFU/mL，極顯著高于其他各組，表明在龍眼多糖添加量為30% 時丁酸梭菌生長的效果最好。因此，在后續(xù)的試驗中，將龍眼多糖添加量暫定為30%。

2.2.2 不同接種量對丁酸梭菌生長的影響 在溫度37℃，龍眼多糖添加量為30%，初始pH 7.0 條件下發(fā)酵14 h 后，當(dāng)接種量為2%時，丁酸梭菌的活菌量最高，達到5.03×108CFU/mL，極顯著高于其他組（圖3），表明在接種量為2%時丁酸梭菌生長的效果最好。因此，在后續(xù)試驗中，將接種量暫定為2%。

2.2.3 不同發(fā)酵時間對丁酸梭菌生長的影響 在溫度37℃，龍眼多糖添加量為30%，接種量2%，pH 為7.0條件下，當(dāng)發(fā)酵時間為14 h 時，丁酸梭菌的活菌量達到最大值，達到2.70×108CFU/mL（圖4），極顯著高于其他發(fā)酵時間，表明在發(fā)酵時間為14 h 時丁酸梭菌生長的效果最好。而當(dāng)發(fā)酵時間超過14 h 后丁酸梭菌的活菌量開始大幅減少，表明此時丁酸梭菌的死亡速度已經(jīng)遠遠超過了生長速度。因此，在后續(xù)試驗中，將發(fā)酵時間暫定為14 h。

2.2.4 不同初始pH 對丁酸梭菌生長的影響 在溫度37℃，龍眼多糖添加量為30%，接種量2%，發(fā)酵時間14 h 條件下，如圖5 所示，當(dāng)初始pH 為6.0 時，丁酸梭菌的活菌量最高，達到1.11×108CFU/mL；初始pH為7.0 時，丁酸梭菌的活菌量為9.80×107CFU/mL，兩者相比無顯著性差異，而其他組丁酸梭菌活菌量與初始pH 為6.0 時相比差異極顯著。因此，最佳初始pH 條件為6.0。

2.3 發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果 按龍眼多糖添加量（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）和初始pH（D）4 個因素，每個因素設(shè)定3 個水平，以發(fā)酵后活菌量為考量指標(biāo)，正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

從表2 中均值和極差結(jié)果可知，各單因素對于發(fā)酵結(jié)果影響的主次順序為C（發(fā)酵時間）＞D（初始pH）＞B（接種量）＞A（龍眼多糖添加量），各因素的最佳搭配為C3D3A1B3。而方差分析結(jié)果顯示各單因素對丁酸梭菌活菌量的影響差異極顯著。因此，丁酸梭菌發(fā)酵龍眼多糖的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為龍眼多糖含量為20%、接種量為3%、發(fā)酵時間為16 h、初始pH 為7.0。

2.4 最優(yōu)發(fā)酵工藝的驗證試驗結(jié)果 利用優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝，即在龍眼多糖添加量20%、接種量15 mL、發(fā)酵時間16 h、初始pH 為7.0 條件下，將丁酸梭菌與龍眼多糖連續(xù)發(fā)酵3 次，通過稀釋涂布平板計數(shù)法測定發(fā)酵后丁酸梭菌的活菌量。如表3 所示，發(fā)酵后丁酸梭菌的活菌量能保持在13×106CFU/mL 以上，均值為15.3×106CFU/mL，驗證了該工藝的穩(wěn)定性。此外，與對照組相比，發(fā)酵后丁酸梭菌的活菌量增長了2.8 倍（P＜0.01）。

表3 活菌計數(shù)結(jié)果

2.5 發(fā)酵前后多糖含量變化結(jié)果 經(jīng)測定發(fā)酵前后發(fā)酵液的OD 值并換算，發(fā)酵前多糖含量均值為1 439.21 mg/mL，發(fā)酵后為1 903.86 mg/mL（表4），發(fā)酵后比發(fā)酵前多糖含量提高了464.65 mg/mL（P＜0.01）。

表4 多糖含量測量結(jié)果 mg/L

3 討 論

本研究從龍眼多糖添加量、接種量、發(fā)酵時間和初始pH 4 個因素對丁酸梭菌發(fā)酵工藝進行探索，發(fā)現(xiàn)各因素在不同水平下對活菌量影響較大。邱權(quán)等[12]報道，液體發(fā)酵是生產(chǎn)丁酸梭菌工藝的關(guān)鍵一步，發(fā)酵培養(yǎng)基的性質(zhì)以及發(fā)酵條件（溫度、pH 及接種量等）都會直接影響到丁酸梭菌液體發(fā)酵的水平。作為異養(yǎng)微生物，丁酸梭菌需要在提供有機碳源的條件下生長，常用的有機碳源有葡萄糖等。本研究在常規(guī)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入龍眼多糖，結(jié)果顯示活菌數(shù)顯著升高，且隨著龍眼多糖添加量的增加而增加，說明多糖物質(zhì)得到了較好利用，龍眼多糖作為一種有機碳源能夠很好地滿足丁酸梭菌的快速生長。丁酸梭菌具有很強的環(huán)境適應(yīng)能力，在范圍較大的發(fā)酵溫度和pH 條件下，較大的初始接種量都有較高的發(fā)酵水平。本研究單因素試驗顯示，在接種量2%時發(fā)酵效果最佳，繼續(xù)增加菌體濃度反而下降，可能是接種量過高，菌體生長旺盛，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快；另一個原因就是接種時可能把種子液中的代謝物（如丁酸、乙酸）一并接入發(fā)酵液當(dāng)中，這些酸類物質(zhì)都會對菌體有一定的抑制作用。丁酸梭菌在中性或偏堿的環(huán)境中發(fā)酵更好[12]。但本研究結(jié)果顯示，pH 6.0 和7.0 時發(fā)酵效果最佳，可能與不同菌株的特性不同有關(guān)。發(fā)酵時間也是對發(fā)酵影響較大的因素。時間太短，發(fā)酵不完全；時間太長，細菌老化的速度相對遠超生長速度。

龔小潔等[13]報道，鮮龍眼果肉接種干酪乳桿菌發(fā)酵后干酪乳桿菌活菌數(shù)增加至109CFU/mL 以上，同時胞外多糖含量明顯增多，含量高達1.5 g/100g。本研究結(jié)果表明，添加龍眼多糖能促進丁酸梭菌的生長，除了活菌數(shù)量檢測結(jié)果之外，在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌發(fā)酵龍眼多糖后產(chǎn)生的刺激性氣味性比對照組更強，分析可能是丁酸等有效成分增加所致，這也間接證明了丁酸梭菌活菌量在添加龍眼多糖后增加。同時，本研究丁酸梭菌發(fā)酵龍眼多糖后發(fā)酵液中的多糖含量也出現(xiàn)增加。微生物的生長代謝具有強大分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，并能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，與一般的物理或化學(xué)手段相比能更大幅度地改變藥性，產(chǎn)生新的化學(xué)成分或活性更強的先導(dǎo)化合物[14]。多糖含量的增加可能是因為丁酸梭菌在發(fā)酵龍眼多糖過程中通過生物轉(zhuǎn)化合成了更多的多糖。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，丁酸梭菌發(fā)酵龍眼多糖的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為龍眼多糖含量為20%、接種量為3%、發(fā)酵時間為16 h、初始pH 為7.0，4 個因素對發(fā)酵過程的影響順序為發(fā)酵時間＞初始pH＞龍眼多糖添加量＞接種量；驗證試驗證實了該發(fā)酵工藝具有一定的穩(wěn)定性，發(fā)酵后丁酸梭菌的活菌量能保持在13×106CFU/mL 以上，比不添加龍眼多糖的活菌量極顯著增長了2.8 倍；發(fā)酵后多糖含量比發(fā)酵前極顯著提高了464.65 mg/mL。因此，本研究所篩選的發(fā)酵工藝為進一步提高含丁酸梭菌益生菌制劑的產(chǎn)品性能提供了新的思路。