王禹盟，齊佳佳，余思聰，鄭 鑫，李子躍，梁 爽，李 所*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062）

隨著動物胚胎工程技術(shù)的發(fā)展，對高質(zhì)量成熟卵母細(xì)胞的需求日益增加。由于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞獲得途徑和數(shù)量的限制，卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）成為獲得成熟卵母細(xì)胞的重要途徑。相較體內(nèi)成熟而言，IVM由于脫離了體內(nèi)微環(huán)境，導(dǎo)致卵丘擴(kuò)散不完全[1]或核質(zhì)成熟不同步等現(xiàn)象發(fā)生，嚴(yán)重影響著卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。因此，模擬體內(nèi)成熟環(huán)境是解決卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量低下的有效途徑。大量研究表明在體外成熟培養(yǎng)液中添加卵泡液能影響卵丘擴(kuò)散和細(xì)胞質(zhì)成熟。而甘氨酸（Glycine）則是輸卵管液、子宮液及卵泡液中含量最高的氨基酸，對卵母細(xì)胞的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[2]。雖然甘氨酸被認(rèn)為是自然界中結(jié)構(gòu)最簡單的非必需氨基酸，但目前研究表明，哺乳動物體內(nèi)合成的甘氨酸并不能滿足機(jī)體代謝需求，仍需要外源補(bǔ)充[3]。近年來，關(guān)于甘氨酸在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中的研究逐漸增多，研究結(jié)果均證實添加甘氨酸可顯著增加卵母細(xì)胞IVM 及體外受精（IVF）效率[4-7]。但此前研究均聯(lián)合使用丙氨酸、精氨酸等氨基酸，對甘氨酸的作用效果并未深入研究。本實驗室前期研究已證明，6 mmol/L 甘氨酸能減少活性氧（ROS）水平、改善線粒體功能，減少細(xì)胞凋亡，從而提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率和胚胎發(fā)育率[8]。本實驗將進(jìn)一步研究甘氨酸對豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量及卵丘細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 豬卵巢是從當(dāng)?shù)赝涝讏鋈』?，選取直徑為3～6 mm 的卵泡，注射器抽出卵泡液及其中的卵子。在TL-HEPES 洗液中用玻璃吸管挑選致密且胞質(zhì)均勻、卵丘細(xì)胞在3 層以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-Oocyte-Complexes，COCs）用于體外成熟培養(yǎng)。用TL-Hepes 液洗滌 3 遍后置于IVM 培養(yǎng)液中，38.5℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)，體外成熟培養(yǎng)液采用NCSU-37 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加10% pFF、1 mmol/L dbcAMP、10 IU/mL hCG、10 IU/mL PMSG培養(yǎng)22 h 后，換液至無激素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)22 h直至44 h COCs 體外成熟。NCSU-37 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加6 mmol/L 甘氨酸作為甘氨酸處理組，不添加組作為對照組，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2 卵丘細(xì)胞擴(kuò)散程度測定及卵丘收集 卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)至44 h，直接在倒置顯微鏡（IX70，Olympus）下測量卵丘細(xì)胞擴(kuò)散情況，分別測量對照組和甘氨酸組卵丘擴(kuò)散后COCs 的2 條垂直直徑，記錄后統(tǒng)計，每組測量30 個。另用吹吸法，利用小孔玻璃管反復(fù)吹吸COCs，機(jī)械地剝離掉卵丘細(xì)胞，分別收集卵丘細(xì)胞和成熟裸卵用于后續(xù)實驗。

1.3 卵母細(xì)胞成熟、死亡的判定 將脫去卵丘細(xì)胞的裸卵放在體外培養(yǎng)（IVC）培養(yǎng)液中洗滌3 次，顯微鏡下挑選排出第一極體的卵母細(xì)胞，且細(xì)胞膜界限清晰的卵母細(xì)胞用于后續(xù)試驗，并認(rèn)定排出極體、細(xì)胞膜界限清晰為達(dá)到核成熟，將卵母細(xì)胞細(xì)胞膜沒有清晰界限的卵子判定為死亡。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測卵丘細(xì)胞凋亡 將收集的卵丘細(xì)胞收集于1.5 mL 離心管中，4 %的多聚甲醛液中室溫下固定30 min，置低溫離心機(jī)，1 000 r/min 離心15 min，棄上清，管底細(xì)胞用 Annexin V-FITC 檢測試劑盒的說明書方法進(jìn)行染色。即加入PBS 懸浮再離心后棄上清液，將細(xì)胞置于100 μL Binding Buffer 重新吹懸，隨后加入Annexin V-FITC 5 μL 和 PI 5 μL，輕輕吹打混勻，在室溫下避光共孵育10～15 min。

檢測細(xì)胞凋亡水平：各處理樣品分別加 100 μL Binding Buffer 稀釋，轉(zhuǎn)入測試管內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測。檢測需在 1 h 內(nèi)完成。Annexin Ⅴ和PI 為2 種不同顏色的染料，可區(qū)分凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。分別用對照（+）和對照（-）來校準(zhǔn)凋亡細(xì)胞，統(tǒng)計各處理組的細(xì)胞凋亡率。

1.5 豬卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 染色 成熟脫卵丘的卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 濃度采用CellTracker blue CMF2HC 進(jìn)行染色，卵母細(xì)胞在38.5℃下，在添加10 μmol/L Cell Tracker Blue CMF2HC 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)30 min，用含0.1%（w/v）PVA 的D-PBS 洗滌3 次，然后置于50 μL 液滴中。在熒光顯微鏡下測量熒光（濾光片在370 nm 激發(fā)下），使用軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。實驗重復(fù)3 次，每組15～20 個卵母細(xì)胞在每個重復(fù)。

1.6 成熟卵母細(xì)胞中MPF 和MAPK 的測定 收集成熟卵母細(xì)胞于PBS+0.1%PVA 的溶液中洗滌3 次，采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞。用豬MPF 和MAPK 測定ELISA試劑盒（上?？婆d生物，中國）進(jìn)行測定，參考Li[9]的方法，按照程序測定。用酶標(biāo)儀對樣本進(jìn)行檢測。樣品中的豬MPF 和MAPK 通過比較與標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

1.7 熒光定量PCR 檢測各基因 mRNA 表達(dá)情況 總mRNA提取用Dynabeads mRNA Direct Kit（Dynal Asa，Oslo，Norway），具體方法參考說明書。RNA 提取濃度和純度使用Nanodrop ND-1000 分光光度計（Biolab，Carmel，IN）進(jìn)行定量，用于cDNA 合成的試劑盒從 Invitrogen 公司（Grand Island，NY）購買。引物由 Invitrogen 公司合成，本實驗中使用的所有引物列表見表1，GAPDH基因作為看家基因。RT-PCR 采用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）和Rotor-Gene?6000 實時旋轉(zhuǎn)分析儀進(jìn)行。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.8 統(tǒng)計分析 每組實驗均重復(fù)3 次以上。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件的t檢驗方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過Nikon Instruments Software Basic Reserch 對平均免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定及分析。qPCR 結(jié)果分析采用經(jīng)典的2-△△Ct法。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘氨酸對豬卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)散的影響 體外成熟培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞前后，分別測量并記錄COCs 的直徑（圖1），檢測卵丘細(xì)胞擴(kuò)散程度，與培養(yǎng)前卵丘細(xì)胞平均直徑相比，6 mmol/L 甘氨酸處理組卵丘細(xì)胞擴(kuò)散平均直徑顯著高于對照組（表2）。

表2 豬卵母細(xì)胞在6 mmol/L 甘氨酸濃度下卵丘擴(kuò)散的情況

2.2 甘氨酸對成熟卵丘細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)測卵丘細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明（圖2），甘氨酸處理組與對照組相比，雖然卵母細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡率均沒有顯著差異，但甘氨酸處理組的豬卵丘細(xì)胞總凋亡率明顯下降，顯著低于對照組。

2.3 甘氨酸對豬成熟卵母細(xì)胞中MPF 和MAPK 水平的影響 如圖3 所示，甘氨酸處理組能極顯著提高成熟卵母細(xì)胞中MPF 和MAPK 水平。

2.4 甘氨酸對成熟卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 水平的影響 如圖4所示，甘氨酸處理組成熟細(xì)胞內(nèi)的 GSH 熒光強(qiáng)度顯著高于對照組。

2.5 甘氨酸對細(xì)胞成熟相關(guān)因子與卵丘凋亡因子的影響熒光定量 PCR 結(jié)果顯示，甘氨酸處理組豬卵母細(xì)胞成熟相關(guān)因子BMP15、GDF9、CyclinB1、CDK1、C-MOS的mRNA 表達(dá)量顯著高于對照組（圖5-A）；卵丘細(xì)胞中細(xì)胞抗凋亡因子Bcl2 的mRNA 表達(dá)量顯著高于對照組（圖5-B）。

3 討 論

卵丘細(xì)胞活力對哺乳動物卵母細(xì)胞成熟、受精及后期胚胎發(fā)育具有重要的意義。卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散程度常作為判斷卵母細(xì)胞成熟及成熟質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)。本團(tuán)隊的前期研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸能提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率[8]。本實驗結(jié)果表明，甘氨酸處理能顯著增加豬卵母細(xì)胞成熟后卵丘擴(kuò)散直徑，表明卵丘擴(kuò)散對豬卵母細(xì)胞體外成熟具有促進(jìn)作用。在體內(nèi)，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散是排卵前的重要步驟，若卵母細(xì)胞擴(kuò)散異常，則會導(dǎo)致后期胚胎發(fā)育能力不足[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細(xì)胞在擴(kuò)散過程中分泌的一些因子與卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟功能相關(guān)[12-13]，卵母細(xì)胞也會分泌旁分泌因子調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞的功能，如BMP15、GDF9高表達(dá)不但可以幫助卵丘細(xì)胞完成擴(kuò)展，同時能促進(jìn)卵丘細(xì)胞對抗凋亡[14-15]。因此，卵丘細(xì)胞的生長、凋亡與卵母細(xì)胞的發(fā)育能力有密切關(guān)系。有研究報道，在人 IVF 胚胎移植后，卵丘細(xì)胞凋亡率低的卵母細(xì)胞其妊娠率更高。Lee 等[16]研究表明，卵丘細(xì)胞的凋亡狀態(tài)可預(yù)測 IVF 后胚胎的發(fā)育情況。以上研究均證實卵丘細(xì)胞的狀態(tài)對卵母細(xì)胞的成熟及后期胚胎發(fā)育能力具有至關(guān)重要的作用[17]。本研究結(jié)果證實了6 mmol/L 甘氨酸具有降低豬卵丘細(xì)胞凋亡率的作用。對卵丘細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的檢測也表明，甘氨酸可以顯著增加卵丘細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2的mRNA 表達(dá)，進(jìn)一步證明甘氨酸能抑制豬卵丘細(xì)胞凋亡，這與前期研究中甘氨酸能提高卵母細(xì)胞成熟率和孤雌激活后的胚胎發(fā)育率的結(jié)論一致。而其原因與甘氨酸能顯著降低ROS水平[8]并促進(jìn)BMP15、GDF9等基因的表達(dá)有關(guān)。

除了卵丘細(xì)胞狀態(tài)可判斷卵母細(xì)胞成熟及質(zhì)量，GSH 作為哺乳動物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，也是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的重要標(biāo)志[18]。甘氨酸與谷氨酸、半胱氨酸共同組成GSH，并參與卵母細(xì)胞的成熟。本研究結(jié)果也證實甘氨酸可以促進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的 GSH 水平的提高，進(jìn)一步促進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟，提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。在前期實驗中，甘氨酸處理顯著提高了豬卵母細(xì)胞體外成熟率，減少ROS 水平[8]，本實驗結(jié)果與前期研究相符合，同時甘氨酸也能阻滯卵丘細(xì)胞的凋亡。MPF 和MAPK 是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的特定調(diào)節(jié)因子。MPF 是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白激酶，啟動卵母細(xì)胞由G2 期進(jìn)入M 期，因此，MPF 在卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)中起著關(guān)鍵作用。MAPK 是細(xì)胞外信號的中心傳導(dǎo)物，與MPF 協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。另有研究表明，在成熟的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中MPF 和MAPK 活性高于未成熟的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的活性[19]，因此豬卵母細(xì)胞中活化的MPF 和MAPK 水平高低可判定細(xì)胞質(zhì)成熟及成熟質(zhì)量。本研究結(jié)果表明，甘氨酸組中MPF 和MAPK 的表達(dá)量顯著高于對照組，說明甘氨酸能有效促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。結(jié)合之前孤雌激活的早期胚胎發(fā)育情況，甘氨酸處理后囊胚率也最高，與Li 等[9]觀點類似，即 MPF 和 MAPK 活性保留，對后期的孤雌胚或者受精胚的發(fā)育提供了有利因素。

關(guān)于甘氨酸對細(xì)胞成熟及其成熟質(zhì)量相關(guān)的因子檢測中，本實驗檢測了BMP15、GDF9、CyclinB1、CDK1、C-MOS的mRNA 表達(dá)情況。BMP15作為卵母細(xì)胞特異性分泌因子，在卵泡的腔前發(fā)育中起著重要的作用[20]。研究表明，BMP15在豬卵母細(xì)胞中表達(dá)，在豬卵丘細(xì)胞中不表達(dá)[21]，高水平表達(dá)的BMP15可抑制豬卵丘細(xì)胞的凋亡[22]，與本結(jié)果相似。GDF9是卵泡生長發(fā)育和卵巢功能的重要調(diào)節(jié)因子，且與卵丘細(xì)胞凋亡息息相關(guān)，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞自身質(zhì)量和受精后胚胎的發(fā)育。CyclinB1是MPF 的亞基，參與有絲分裂和減數(shù)分裂的調(diào)節(jié)，其與CDK1結(jié)合，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的后期。C-MOS在MAPK 通路中起非常關(guān)鍵的作用。這些因子在甘氨酸處理下均顯著高于對照組，進(jìn)一步說明甘氨酸可提高卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果證明甘氨酸能顯著提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量和卵丘擴(kuò)散情況，并且降低卵丘細(xì)胞凋亡。