張壯彪，劉秋月，狄 冉，胡文萍，王翔宇，賀小云，馬 琳，儲明星

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193)

綿羊（Ovis aries）屬于牛科綿羊?qū)?，具有毛皮柔軟、肉質(zhì)鮮美、膽固醇含量較低等特點，深受人們喜愛。綿羊是世界上最早被馴化的動物之一，有超過10 億只大約130 多個品種分布在世界各地，以滿足人們?nèi)粘ρ虍a(chǎn)品的需求。從發(fā)情周期來看，綿羊可分為季節(jié)性發(fā)情和全年發(fā)情2 類，發(fā)情周期的長短直接導(dǎo)致綿羊年產(chǎn)羔數(shù)不同，因此季節(jié)性發(fā)情是限制綿羊高繁殖力的重要因素[1]，因此縮短發(fā)情周期、增加產(chǎn)羔數(shù)是提高綿羊繁殖力的重要舉措。

產(chǎn)羔數(shù)作為綿羊繁殖力高低的重要指標(biāo)，其對養(yǎng)羊業(yè)的貢獻(xiàn)可達(dá)75%～95%，且產(chǎn)雙羔的綿羊其經(jīng)濟(jì)效益是產(chǎn)單羔羊的1.6 倍[2]。研究表明，遺傳、飼養(yǎng)、營養(yǎng)等多種因素均可以影響綿羊的產(chǎn)羔數(shù)，其中遺傳因素占很大比重，如某些基因可直接影響到綿羊的排卵數(shù)[3-5]。鑒于此，研究人員對影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的基因展開了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)FecB[6]、GDF9[7]、BMP15[8]等基因顯著影響綿羊的產(chǎn)羔數(shù)。其中首先被發(fā)現(xiàn)并展開研究的是FecB基因，攜帶該基因的綿羊群體是1950 年左右由澳大利亞人選育出來的，他們發(fā)現(xiàn)被選育的綿羊群體（Booroola sheep）的產(chǎn)羔數(shù)比未被選育的綿羊群體高30%，之后Davis 等[9]對該基因進(jìn)行了分離，1982 年國際綿羊和山羊遺傳學(xué)命名委員會正式將該基因命名為FecB（Fecundity Booroola，F(xiàn)ecB）。1994年，Montgomery 等[10]通過半同胞和全同胞連鎖分析、微衛(wèi)星標(biāo)記將該基因定位到了綿羊6 號染色體。2001年，Souza 等利用基因組定位以及已知的基因連鎖和染色體定位發(fā)現(xiàn)FecB基因是來源于Bone Morphogenetic Protein receptor type 1 B（BMPR1B）的位點突變，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)是該基因的746 位A 突變?yōu)镚，導(dǎo)致了249 位谷氨酰胺到精氨酸的氨基酸突變[11-12]，該突變會導(dǎo)致綿羊排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的增加，攜帶一個FecB突變拷貝使排卵數(shù)增加1.26 個，產(chǎn)羔數(shù)增加0.67 只；兩個拷貝數(shù)使排卵數(shù)、產(chǎn)羔數(shù)分別增加3.61 個和0.77 只[13]。此后研究人員對該基因如何影響綿羊繁殖力展開了深入研究，Campbell 等[14]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)該基因可以在綿羊卵巢發(fā)揮作用，Davis 等[15]也開展了該基因?qū)d羊排卵數(shù)影響的研究。近年來隨著測序技術(shù)的發(fā)展，利用組學(xué)技術(shù)研究FecB對綿羊繁殖力的影響成為一個熱點，Miao 等[16]在小尾寒羊卵巢中利用全轉(zhuǎn)錄組測序比較了不同F(xiàn)ecB基因型中miRNAs 和mRNAs 的表達(dá)差異，并揭示了與繁殖相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，Guo 等[17]從代謝組學(xué)角度探究了FecB基因?qū)β雅菀汉吐殉察o脈血成分的影響，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽、葡萄糖-6-磷酸等與綿羊的排卵數(shù)顯著相關(guān)。對于該基因在我國綿羊群體中的分布，研究人員也展開了相應(yīng)的基因檢測工作，Chu 等[18]發(fā)現(xiàn)該FecB基因同樣存在于中國的綿羊品種中，如小尾寒羊、湖羊等。鑒于該基因?qū)︷B(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的重大意義，本團(tuán)隊響應(yīng)FecB基因大規(guī)模檢測的需要，制定了FecB基因檢測的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并在多地推廣示范，取得了良好的效果[19]。

基于前期基礎(chǔ)，本課題組開發(fā)了FecB基因高效檢測的TaqMan 探針分型技術(shù)。利用該技術(shù)，本課題組在2008—2018 年檢測了10 個綿羊群體16 460 只綿羊的FecB基因分布情況，并根據(jù)檢測結(jié)果建立了肉用多羔綿羊核心群。

1 材料和方法

1.1 樣本采集 10 個綿羊群體的采樣時間、地點以及數(shù)量見表1。每只綿羊頸靜脈采血量≥5mL，采集的血液保存于含有EDTA 的抗凝管中，-4℃保存，并用干冰帶回北京。用試劑盒提取綿羊基因組DNA，提取的DNA于-20℃保存。

1.2 產(chǎn)羔數(shù)跟蹤與記錄 2008—2018 年，構(gòu)建小尾寒羊和雜交羊的核心群，并對其中842 只（小尾寒羊）、544 只（小尾寒羊高繁核心群）、310 只（雜交羊）母羊進(jìn)行前3 胎產(chǎn)羔數(shù)跟蹤、記錄。

1.3 SNP 分型 利用TaqMan 探針法分型，見劉秋月等[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析 經(jīng)過熒光定量TaqMan 探針法分型后，統(tǒng)計FecB各基因型的數(shù)目，經(jīng)Excel 處理后獲得基因型頻率和等位基因頻率，計算其卡方值和顯著性，根據(jù)P值判斷該群體是否處于Hardy-Weinberg 平衡（P≥0.05為Hardy-Weinberg 平衡），利用SPSS19.0 采取一般線性模型單因素方差分析中的最小顯著差異（Least significant difference，LSD）對不同基因型的小尾寒羊及其雜交羊進(jìn)行產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同綿羊群體FecB基因的分布 對10 個綿羊群體16 460 只綿羊進(jìn)行FecB基因型檢測，結(jié)果如表2 所示。由表2 可知，采樣的小尾寒羊群體B+基因型頻率最高，其次是BB 和++，B 等位基因頻率為0.6 左右；我國另一高繁殖力品種湖羊其BB 型頻率達(dá)到了0.85 以上，高于B+（0.1 左右）和++（0.01），B 等位基因頻率高達(dá)0.93；昭烏達(dá)綿羊、灘羊、巴美肉羊、杜泊羊以及薩福克羊其++基因型頻率均在0.80 以上，且BB 基因型頻率均為0，B 等位基因頻率小于0.1；魯中肉羊是萊蕪市嬴泰有機農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所等機構(gòu)，利用白杜泊羊和湖羊進(jìn)行雜交培育出的適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境的肉羊新類群[21]，通過FecB基因檢測發(fā)現(xiàn)：B+基因型頻率（大于0.52）高于BB（小于0.33）和++（小于0.28），B、+等位基因頻率均在0.5左右；對于雜交羊，如寒雜羊其BB 型頻率均在0.3 以上，B 等位基因頻率在0.6 左右。有一部分群體如巴美肉羊、魯中肉羊和湖羊等已經(jīng)處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

2.2 小尾寒羊多羔核心群的建立 2008—2018 年，本研究團(tuán)隊檢測了山東、內(nèi)蒙古、河北、北京等地小尾寒羊FecB突變，選擇BB 型和B+型公母羊組建了小尾寒羊高繁殖力核心群。根據(jù)FecB突變檢測結(jié)果，從4 460 只小尾寒羊中選取900 只組建了小尾寒羊多羔核心群（BB、B+和++型母羊分別有440 只、416 只和44 只）（表3）。同時選取具有產(chǎn)羔記錄的842 只（普通群）、544 只（核心群）小尾寒羊進(jìn)行產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析（表4）。統(tǒng)計結(jié)果表明核心群中B 等位基因頻率較普通群有所提高；BB 基因型小尾寒羊核心群平均產(chǎn)羔數(shù)比普通群多0.49只，B+基因型比普通群多0.32 只，++基因型比普通群多0.05 只；且無論普通群還是核心群，其BB 型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)均極顯著高于B+（P＜0.01），B+型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)均極顯著高于++（P＜0.01）。結(jié)果表明B 等位基因與小尾寒羊高產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)，說明在生產(chǎn)實踐中利用FecB突變選育多羔品系是可行的。

表1 樣品采集信息

表2 不同綿羊群體FecB 基因分布情況

表3 不同小尾寒羊群體FecB 基因型頻率和等位基因頻率

表4 不同小尾寒羊群體FecB 基因型產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

2.3 肉用多羔綿羊核心群的建立 已對以國外肉用綿羊品種（杜泊、多賽特、薩福克、特克塞爾等）為父本，以多羔并四季發(fā)情的小尾寒羊為母本雜交產(chǎn)生的F1代雜種母羊和F1代雜種公羊、F1代雜種母羊和F1代雜種公羊橫交產(chǎn)生的F2代雜種母羊和F2代雜種公羊、F1代雜種母羊與國外肉用綿羊公羊回交或F1代雜種公羊與小尾寒羊母羊回交產(chǎn)生的B1代雜種母羊和B1代雜種公羊進(jìn)行了FecB突變檢測，共檢測了2 500 只雜種母羊和156 只雜種公羊。根據(jù)FecB突變檢測結(jié)果建立了肉用多羔綿羊核心群（BB 基因型公母羊分別有26 只和225 只，B+基因型公母羊分別有91 只和1 650 只）。對其中具有第1～3 胎產(chǎn)羔數(shù)記錄的310 只雜種母羊的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計分析，不同F(xiàn)ecB基因型雜種母羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤見表5。由表5 可知，BB 基因型雜種母羊平均產(chǎn)羔數(shù)比B+基因型多0.63 只（P＜0.01），比++基因型多1.17 只（P＜0.01）；B+基因型雜種母羊平均產(chǎn)羔數(shù)比++基因型多0.54 只（P＜0.01）。結(jié)果表明B 等位基因與雜種母羊產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

3.1 不同綿羊群體FecB基因的分布及肉羊多羔核心群的構(gòu)建 對10 個綿羊群體16 460 只綿羊進(jìn)行FecB基因型檢測，發(fā)現(xiàn)小尾寒羊、湖羊等均含有FecB突變，該結(jié)果與李達(dá)等[22]、馬麗娜等[23]報道一致。小尾寒羊群體BB、B+和++基因型頻率的檢測結(jié)果與劉秋月等[20]的檢測結(jié)果基本一致，但B 等位基因的頻率與之前報道不一致，低于楊宇澤等[24]的報道。另一高繁殖力品種湖羊其BB 基因型頻率在0.9 左右，這與劉秋月等[20]檢測結(jié)果一致，王根林等[25]和李達(dá)等[22]研究表明湖羊的B 等位基因頻率為0.8～1.0，本實驗中2 個湖羊群體的B 等位基因頻率均在該范圍內(nèi)。額爾和花等[26]對純種灘羊和湖灘雜交的綿羊進(jìn)行了FecB基因的檢測，發(fā)現(xiàn)所檢測的純種灘羊其基因型均為++型，但與湖羊雜交后代BB 型達(dá)到66.7%，說明通過引入外血提高灘羊的產(chǎn)羔數(shù)是可行的，進(jìn)一步為灘羊多羔品系的選育提供了依據(jù)。孫紅霞等[27]研究表明灘羊B 等位基因的頻率為0.02～0.22，劉秋月等[20]研究表明灘羊BB 基因型頻率為0～0.49，巴美肉羊、昭烏達(dá)綿羊BB 基因型頻率為0，B 等位基因頻率在0～0.3 之間。在本實驗中，灘羊、巴美肉羊、昭烏達(dá)綿羊等低繁殖力品種其BB 基因型頻率為0，且B 等位基因頻率均小于0.1。本實驗檢測結(jié)果與上述研究基本相符。對于無FecB基因突變的綿羊群體，可以通過雜交引入FecB突變，如雜交后的魯中肉羊、寒雜羊其BB 基因型頻率均大于0.19，該檢測結(jié)果為通過引入含有FecB基因的綿羊的外血來培育綿羊多羔品系提供了實踐依據(jù)，同時說明利用FecB基因的分子標(biāo)記輔助選擇培育綿羊多羔品系具有良好的效果。但有一部分群體如巴美肉羊、魯中肉羊和湖羊等經(jīng)過長期的人工選擇，已經(jīng)處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)（P＜0.05），說明人工選擇的方法可以顯著提高群體中某一基因型的頻率，同時也說明了在實際育種工作中通過正確的人工選擇可以縮短育種年限，提高育種效率。

表5 不同F(xiàn)ecB 基因型雜交羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

多個綿羊或山羊群體核心群的成功構(gòu)建證明了核心群構(gòu)建的重要性[28-30]。本團(tuán)隊通過與多個企業(yè)共同努力，建立了多個多羔肉用綿羊核心群，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)基于FecB基因型進(jìn)行綿羊多羔品系培育是行之有效的。核心群的建立為多羔綿羊培育提供了良好的遺傳資源。

3.2FecB基因的應(yīng)用前景及其注意事項FecB基因在肉羊生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景，但同時也有一些注意事項。首先對于攜帶該基因的小尾寒羊和湖羊等群體來說，未來的重點是要進(jìn)行本品種選育，繼續(xù)提高種質(zhì)。目前應(yīng)重點關(guān)注對養(yǎng)羊業(yè)有重要影響的體格、體重和產(chǎn)羔數(shù)；也可以利用國外優(yōu)良的綿羊品種如杜泊羊等做父本、小尾寒羊等做母本，進(jìn)行雜交培育肉用多羔新品種；還可以根據(jù)不同F(xiàn)ecB基因型對綿羊生產(chǎn)性能、繁殖性能等的影響來選擇合適的基因型群體進(jìn)行飼養(yǎng)，如在北京地區(qū)飼養(yǎng)B+型小尾寒羊可獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益[31]。

雖然攜帶FecB突變的綿羊可以帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益，但是長遠(yuǎn)來看過分引入外血會使某些羊的優(yōu)良性狀消失，導(dǎo)致遺傳資源過于單一，所以要在保證一定量的原始群體的基礎(chǔ)上適度引入外血，這需要政府和養(yǎng)殖人員的共同努力。有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入FecB基因后會導(dǎo)致BB 型生長速度偏慢[32]、相同月齡的體重不同[33]等問題，所以在進(jìn)行FecB雜交之前要充分考慮雜交的目的。一般來說，++型小尾寒羊產(chǎn)單羔，但是研究發(fā)現(xiàn)該基因型綿羊也存在產(chǎn)多羔現(xiàn)象，可能存在除FecB之外的主效基因，但具體機理還不清楚[34]，因此利用高通量技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)育種方法檢測新的影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的候選基因可能是未來科研人員和育種工作者的一個新方向。

4 結(jié) 論

通過對綿羊多羔性狀主效基因FecB的檢測，比較清楚了解了各綿羊群體多羔基因的攜帶情況，進(jìn)一步為肉用多羔綿羊核心群的建立、提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)以及肉羊遺傳改良或者新品種培育提供了優(yōu)良的遺傳學(xué)素材。