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        載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及體外評價

        2020-03-07 03:49:38陳敏燕吳飛華原永芳
        藥學(xué)服務(wù)與研究 2020年1期
        關(guān)鍵詞:絞股藍(lán)溶出度均質(zhì)

        陳敏燕,楊 剛,吳飛華,原永芳

        (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科,上海 200011)

        絞股藍(lán)[Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino]為我國常用的藥食同源品,可以起到保護(hù)心腦血管、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、增強免疫力等作用,因其獨特的功效,在醫(yī)藥、食品、保健品中被廣泛應(yīng)用。絞股藍(lán)的主要活性成分是絞股藍(lán)皂苷[1],與其他皂苷類成分一樣,絞股藍(lán)皂苷性質(zhì)不穩(wěn)定,在腸內(nèi)菌作用下被代謝成多種代謝產(chǎn)物,在胃液中也容易被降解[2];另外,較差的水溶性和脂溶性也影響其生物利用度[3]。目前,市售制劑主要有絞股藍(lán)含片、絞股藍(lán)總苷膠囊、絞股藍(lán)口服液以及復(fù)方絞股藍(lán)等。為改善其生物利用度,國內(nèi)外研究人員還將其制備成微囊、脂質(zhì)體等制劑[4-5]。

        納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers,NLCs)是繼固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles,SLNs)之后的二代脂質(zhì)體系,與SLNs不同之處在于,它是采用混合類脂為載體材料,將液態(tài)脂質(zhì)混合到固體脂質(zhì)中制備而得,載體中具有較高的晶體缺陷,可以容納更多的藥物分子,使其具有更高的載藥能力[6]。同時,NLCs還保留了SLNs緩釋、生物相容性好、易制備的優(yōu)點,且增強了穩(wěn)定性[7]。與微囊和脂質(zhì)體等劑型相比,NLCs具有載藥量高、生物穩(wěn)定性好、緩釋效果顯著等優(yōu)勢。高壓均質(zhì)法是目前報道的制備NLCs的主要方法,該方法操作簡便,易于控制,且可避免使用對人體有害的附加有機(jī)溶劑[8]。本文采用高壓均質(zhì)法制備載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(GPS-NLCs),并對其體外釋放行為進(jìn)行了考察,現(xiàn)報道如下。

        1 材 料

        1.1 儀器 高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司);RC-806溶出度儀(天津因賽科技發(fā)展有限公司);NS1001L高壓均質(zhì)機(jī) (意大利GEA Niro Soavi公司);Nano ZS 90激光粒度儀(英國Malvern公司);D8 Advance X射線衍射儀(德國布魯克公司);Q2000差示掃描量熱儀(美國TA公司);T25高度分散儀(德國IKA公司);超濾離心管(美國Pall公司)。

        1.2 藥品和試劑 絞股藍(lán)皂苷對照品(純度>98%,批號112033-201701,中國食品藥品檢定研究院);絞股藍(lán)皂苷原料藥(純度≥95%,批號 S31402-5g,上海源葉生物科技有限公司);單硬脂酸甘油酯 (國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司);單亞油酸甘油酯(Maisine 35-1)和油?;垡叶ジ视王?Labrafil M1944 CS)由法國Gattefossé公司提供;大豆磷脂(Lipoid S 100,德國Lipoid公司);吐溫-80 (美國Sigma公司);乙腈(色譜純,德國Merck公司);其余試劑均為分析純。

        2 方法和結(jié)果

        2.1 絞股藍(lán)皂苷分析方法的建立

        2.1.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(35∶65);檢測波長:203 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μl。在該色譜條件下,絞股藍(lán)皂苷峰的理論塔板數(shù)≥10 000,分離度>1.5。

        2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取絞股藍(lán)皂苷對照品適量溶于甲醇,分別配制成濃度為2、12、30、60、90、150 μg/ml的絞股藍(lán)皂苷對照溶液,分別吸取20 μl,注入高效液相色譜儀,記錄峰面積值(A),以濃度(c)對A作線性回歸,得到回歸方程為:A=9.249c+21.253(r=0.999 4)。結(jié)果表明,在2~150 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.2 GPS-NLCs及GPS-SLNs的制備 (1)GPS-NLCs的制備:采用高壓均質(zhì)法制備GPS-NLCs。將處方量的混合脂質(zhì)(固體脂質(zhì)為單硬脂酸甘油酯,液態(tài)脂質(zhì)為單亞油酸甘油酯和油酰基聚乙二醇甘油酯)水浴加熱至65 ℃,攪拌條件下充分混合,熔融得到油相;將處方量的絞股藍(lán)皂苷和乳化劑(大豆磷脂∶吐溫-80=1∶1)置于燒杯中混合后,加適量蒸餾水?dāng)嚢枞芙?,并加熱至油相的溫度,即得到水相。在T25高度分散儀高速分散下,將水相加入到油相中,持續(xù)攪拌一段時間,得到初分散體系,再經(jīng)高壓乳勻,即得GPS-NLCs。以粒徑和多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)為指標(biāo),對分散儀的攪拌功率、攪拌時間、均質(zhì)壓力以及均質(zhì)次數(shù)這4個參數(shù)進(jìn)行篩選。工藝參數(shù)的設(shè)置以及各參數(shù)下制備的GPS-NLCs的粒徑和PDI見表1。由表1可知,攪拌功率對粒徑和PDI的影響均較小,隨著攪拌時間、均質(zhì)壓力以及均質(zhì)次數(shù)的增加,粒徑呈先減小后增大的趨勢??紤]到均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)的增加會導(dǎo)致體系溫度升高,粒徑減小,故確定工藝參數(shù)如下:攪拌功率6000 W,攪拌時間6 min,均質(zhì)壓力80 MPa(800 bar),均質(zhì)次數(shù)8次。 (2)GPS-SLNs的制備:僅以固態(tài)脂質(zhì)替代液態(tài)脂質(zhì),其余組分與GPS-NLCs處方相同,采用高壓均質(zhì)法以同樣的工藝制備GPS-SLNs。

        表1 高壓均質(zhì)法制備GPS-NLCs的工藝參數(shù)優(yōu)化Table 1 Optimization of the process parameters of GPS-NLCs prepared by high-pressure homogenization method

        2.3 理化性質(zhì)考察

        2.3.1 粒徑及zeta電位的測定 將制備好的GPS-NLCs用適量去離子水稀釋后,測定粒徑及zeta電位。GPS-NLCs的平均粒徑為(159.6±6.6) nm,PDI為(0.221±0.009),其粒徑分布較窄,為60~200 nm,GPS-NLCs的zeta電位為(-31.1±1.3) mV,表明制得的納米粒表面帶負(fù)電荷,穩(wěn)定性較好。

        2.3.2 包封率及載藥量的測定 采用超濾法測定GPS-NLCs的包封率(entrapment efficiency,EE)及載藥量(drug loading,DL)。精密移取0.5 ml制得的GPS-NLCs混懸液,加入適量乙腈破乳,超聲(功率500 W)30 min后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,用HPLC法測定GPS濃度,計算總藥量(W總)。另取0.5 ml GPS-NLCs置超濾離心管中(截留分子量10 ku),以相對離心力2.795×103×g離心15 min,取濾液,經(jīng)HPLC法測定,計算游離指標(biāo)性成分的含量(W游離)。參照下列公式分別計算包封率和載藥量:EE=(W總-W游離)/W總×100%,DL=(W總-W游離)/W脂質(zhì)×100%,其中W脂質(zhì)為制劑中加入的脂質(zhì)材料的質(zhì)量。測得GPS-NLCs的包封率和載藥量分別為(74.30±3.17)%和(4.91±0.39)%(n=3),表明NLCs對藥物有較好的包裹和裝載能力。

        2.3.3 形態(tài)觀察 利用透射電鏡(transmission electron microscopy)對GPS-NLCs的外觀形態(tài)進(jìn)行觀察。將GPS-NLCs分散于適量去離子水中,取適量滴加至銅網(wǎng)上自然干燥,約20 min后形成薄膜,再滴加2%磷鎢酸負(fù)染10 min,用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸除多余液體,晾干后放至透射電鏡下進(jìn)行觀察。GPS-NLCs的透射電鏡觀察結(jié)果見圖1。由圖1可見,納米粒近球形,分布較均勻。

        圖1 GPS-NLCs的透射電鏡圖Figure 1 Transmission electron micrograph of GPS-NLCsGPS-NLCs:載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體

        2.4 體外溶出實驗 為了驗證 NLCs 在提高藥物溶出度上的優(yōu)勢,將其與絞股藍(lán)皂苷原藥粉混懸液以及初代脂質(zhì)體系SLNs進(jìn)行比較,采用透析袋法對各制劑的體外溶出行為進(jìn)行考察。將制備好的GPS-NLCs、GPS-SLNs以及絞股藍(lán)皂苷混懸液各5 ml加至處理好的透析袋內(nèi),透析袋兩端用醫(yī)用編織線扎緊,用橡皮筋固定在攪拌漿上,浸沒在100 ml溶出介質(zhì)[PEG 400的生理鹽水溶液,PEG 400∶生理鹽水=1∶4(V/V)]中,恒溫(37±0.5) ℃,攪拌速度為120 r/min,采用槳法。分別于特定時間點吸取溶液1 ml,同時補充等體積空白溶出介質(zhì),樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后,經(jīng)HPLC法測定GPS濃度。每種制劑做3份平行操作。

        釋藥曲線如圖2所示,絞股藍(lán)皂苷原藥粉的溶出速率要高于SLNs組和NLCs組,在30 min內(nèi)就達(dá)到了溶解平衡。SLNs組和NLCs組則在40 h后才達(dá)到溶解平衡,這是由于藥物要通過脂質(zhì)層才得以釋放。同時,SLNs組和NLCs組的體外累積溶出度均明顯高于原藥粉組。推測原因可能是因為經(jīng)高壓均質(zhì)制成SLNs和NLCs后,藥物可能以無定型狀態(tài)存在于載體中[9]。此外,NLCs組在48 h內(nèi)的體外累積溶出度要高于SLNs組,可能是由于液態(tài)脂質(zhì)的加入打亂了納米粒的有序結(jié)構(gòu)排列,使得NLCs具有更高的體外累積溶出度[10]。因此,NLCs能夠顯著改善絞股藍(lán)皂苷原藥粉的溶出度。與SLNs相比,NLCs在改善藥物溶出度上也具有一定的優(yōu)勢。

        圖2 GPS的釋藥曲線Figure 2 Drug release profiles of GPS○:GPS混懸液;●:GPS-SLNs;△:GPS-NLCs;GPS:絞股藍(lán)皂苷;GPS-SLNs:載絞股藍(lán)皂苷固體脂質(zhì)納米粒;GPS-NLCs:載絞股藍(lán)皂苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體;

        3 討 論

        絞股藍(lán)皂苷水溶性差,性質(zhì)不穩(wěn)定,限制了其在臨床的應(yīng)用。本研究采用高壓均質(zhì)法將其制成GPS-NLCs,提高了其體外釋放,且GPS-NLCs釋藥特點是前期快速釋放,后期緩慢釋藥,具有明顯的緩釋效果。GPS-NLCs體外釋放顯著提高的原因可能是降低了制劑的粒徑,增大了其比表面積。從藥物學(xué)來說,藥物的溶出速率與藥物顆粒的比表面積成正比,而比表面積與粒徑成反比。因此,藥物的粒徑越小,其比表面積越大,接觸周圍介質(zhì)的面積愈大,越有助于藥物有效成分的溶出[11]。GPS-NLCs粒徑約為160 nm,降低粒徑后增大了比表面積和藥物飽和溶解度,從而提高了藥物的釋放量。GPS-NLCs的生物利用度有待通過藥動學(xué)試驗進(jìn)一步研究,期望本研究能為絞股藍(lán)新型制劑的研究和開發(fā)提供一定實驗基礎(chǔ)。

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