何彩文，蔣詠梅，章文賢

（工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350117）

茯苓是一種寄生在松樹根部的真菌，具有菌核、菌絲體和子實(shí)體3種形態(tài)特征。茯苓多糖是真菌茯苓中具有多種藥理作用的主要活性成分，含量高達(dá)93%以上，主要存在于茯苓的細(xì)胞壁中。茯苓多糖中有水溶性多糖和堿溶性多糖兩種類型，其中多數(shù)為堿溶性多糖。大量研究表明，茯苓多糖可治療腹瀉、嘔吐、水腫、驚悸等癥狀，具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等生理活性，以及降血糖、鎮(zhèn)靜催眠、和胃益脾、退黃疸、消結(jié)石、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老和改善學(xué)習(xí)記憶等藥理作用[1-4]，在臨床醫(yī)學(xué)、食品藥膳以及美容保健等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[5]。

茯苓生產(chǎn)有固體栽培和液體發(fā)酵兩種途徑，野生茯苓和傳統(tǒng)栽培的人工種植茯苓均屬于固體培養(yǎng)。隨著現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，目前越來越多的方法采用液體深層發(fā)酵生產(chǎn)茯苓，對(duì)茯苓菌絲的生長條件和產(chǎn)物合成條件進(jìn)行優(yōu)化[6-9]。培養(yǎng)基的組成和環(huán)境條件，以及種子液的菌齡和接種量都會(huì)影響發(fā)酵結(jié)果。本研究采用一種液體搖瓶培養(yǎng)結(jié)合靜置培養(yǎng)的方法生產(chǎn)茯苓多糖，找出對(duì)茯苓菌的生長和對(duì)茯苓多糖合成效果均最好的液體培養(yǎng)時(shí)間和靜置培養(yǎng)時(shí)間，初步為采用這一方法生產(chǎn)茯苓多糖提供工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)7 d的斜面茯苓菌絲由福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏并提供。

1.2 培養(yǎng)基制備

（1）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，瓊脂粉 16 g。

（2）種子培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖 35 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 2.5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 為 6.0。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖 35 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 為 6.0.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茯苓胞內(nèi)多糖（IPS）的提取及測定

稱取茯苓干細(xì)胞粉末100 mg，加入1 mol/L氫氧化鈉于60 ℃水解1 h后，用水稀釋一定倍數(shù)，用濃硫酸-苯酚法測定胞內(nèi)多糖含量[9]。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化方法

種子液制備：用無菌水10 mL，水洗28 ℃條件下培養(yǎng)6 d的斜面一支，接入裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，搖床（28 ℃，160 r/min）發(fā)酵，培養(yǎng)72 h，即為種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：500 mL搖瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基200 mL，接種量按 10% 接種，搖床（28 ℃，160 r/min）發(fā)酵，培養(yǎng)相應(yīng)天數(shù)。

搖瓶培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定 2 d、3 d、4 d 和 5 d；靜置培養(yǎng)時(shí)間 4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 和 14 d。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜置前液體發(fā)酵時(shí)間對(duì)茯苓菌絲細(xì)胞生長的影響

考察不同靜置前培養(yǎng)時(shí)間對(duì)后續(xù)靜置過程產(chǎn)生的影響。圖1結(jié)果表明，靜置前培養(yǎng)時(shí)間越長，越不利于茯苓菌絲的獲得，在第4 d和第8 d測定菌絲干重，均是培養(yǎng)2 d時(shí)細(xì)胞量最大，但在第4～8 d的生長過程中，靜置前培養(yǎng)時(shí)間越長，細(xì)胞的生長速率越大，前培養(yǎng) 2 d 和 5 d 的生長速率分別是 0.85 g/(L·d)和 1.13 g/(L·d)。

圖1 靜置前液體發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長的影響

2.2 靜置前液體發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響

靜置前液體發(fā)酵時(shí)間對(duì)茯苓菌絲胞內(nèi)多糖的積累影響較大。從圖2可見，經(jīng)過3 d前培養(yǎng)的菌絲，茯苓菌絲胞內(nèi)多糖含量最高，在靜置培養(yǎng)4 d和8 d后，胞內(nèi)多糖含量分別高達(dá) 6.3 g/100 g 和 9.3 g/100 g CDW（CDW為細(xì)胞干重）。結(jié)合細(xì)胞量，如圖3所示，計(jì)算胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量同樣是在前培養(yǎng)3 d時(shí)最高，在靜置8 d時(shí)，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到1.14 g/L。后續(xù)試驗(yàn)中采用前培養(yǎng)3 d的條件。

圖2 靜置前液體發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖含量的影響

圖3 靜置前液體發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.3 靜置時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長的影響

在液體培養(yǎng)3 d后開始靜置培養(yǎng)，考察靜置培養(yǎng)時(shí)間對(duì)茯苓菌絲生長的影響。圖4結(jié)果表明，隨著靜置培養(yǎng)天數(shù)的增加，茯苓菌絲細(xì)胞干重迅速增長，超過5 d時(shí)細(xì)胞干重的增長趨勢逐漸平緩，當(dāng)靜置培養(yǎng)天數(shù)約為12 d時(shí)細(xì)胞干重達(dá)到最大值，為 13.5 g/L。

圖4 靜置發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長的影響

2.4 靜置時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖含量和產(chǎn)量的影響

圖5結(jié)果表明，隨著天數(shù)增加，茯苓菌絲胞內(nèi)多糖含量逐漸增多且增加趨勢逐漸平緩，在靜置培養(yǎng)時(shí)間為 10 d時(shí)胞內(nèi)多糖含量達(dá)到最大值，為 9.8 g/100 g CDW，之后胞內(nèi)多糖含量下降。因此，靜置培養(yǎng)10 d是茯苓菌絲胞內(nèi)多糖含量的最佳時(shí)間。從胞內(nèi)多糖產(chǎn)量來看，如圖6所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量不斷上升，在第10 d時(shí)達(dá)到最大值，為1.28 g/L。

圖5 靜置發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖含量的影響

圖6 靜置發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

本研究采用搖瓶培養(yǎng)結(jié)合靜置培養(yǎng)的方法研究茯苓菌絲的生長和胞內(nèi)多糖的合成。發(fā)現(xiàn)搖瓶培養(yǎng)時(shí)間和靜置培養(yǎng)時(shí)間對(duì)茯苓菌絲的生長和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量有明顯影響，經(jīng)3 d搖瓶培養(yǎng)和10 d靜置培養(yǎng)的茯苓菌絲胞內(nèi)多糖產(chǎn)量高達(dá)1.28 g/L，可見這種兩階段培養(yǎng)的方式是一種生產(chǎn)茯苓多糖的有效新方法。