閆東科，許鳳霞，呂平，李冬

（天津職業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，天津 300350）

乳腺癌是世界范圍內(nèi)常見的一種女性癌癥。2017年全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，乳腺癌的發(fā)病率高達30%，排在首位，且乳腺癌的死亡率為14%，僅次于肺癌[1]。在我國，乳腺癌是導(dǎo)致女性癌癥患者死亡的首要原因[2]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，尋找用于乳腺癌早期診斷和治療的分子靶標已成為當前乳腺癌研究的熱點。例如，針對人類表皮生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor-2，HER-2）靶標的重組人源化單克隆抗體帕妥珠單抗[3]（Pertuzumab，商品名Perjeta，帕捷特），已于2018年12月被我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準上市，用作HER-2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的靶向治療藥物。

而在癌癥治療分子靶標研究中，細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是研究特定基因表達調(diào)控的重要技術(shù)手段之一。其中，電穿孔法作為一種常用的細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，具有轉(zhuǎn)染效率高、轉(zhuǎn)染操作程序簡單、快捷、實驗重復(fù)性好、樣本處理量大、無殘留毒性以及適用范圍廣泛等優(yōu)點，不僅可用于對干細胞、原代細胞、細胞系的轉(zhuǎn)染，而且可用于對類器官、受精卵（胚胎）、活體（離體）組織器官[4]、昆蟲[5]和藻類[6]以及植物種子[7]、花粉、原生質(zhì)體等的轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染是利用高于某一閾值的外加電脈沖刺激細胞膜，導(dǎo)致細胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)重排，形成瞬時性孔洞，從而使外源生物大分子通過孔洞導(dǎo)入細胞的過程。也有研究認為，電脈沖對生物大分子與細胞膜的結(jié)合起促進作用，生物大分子是通過細胞膜的內(nèi)吞作用進入細胞的[8]。影響電轉(zhuǎn)染效率的因素眾多，不同細胞系最佳電轉(zhuǎn)染條件也不盡相同。本次實驗以目前常用的乳腺癌細胞模型人乳腺癌細胞系MCF-7為研究對象，研究電轉(zhuǎn)染時的電壓、電脈沖時長、電脈沖次數(shù)、質(zhì)粒濃度和細胞傳代時間對其電轉(zhuǎn)染效率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細胞

pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒購自豐暉生物科技有限公司；大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α為本實驗室保存；人乳腺癌MCF-7細胞購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

無血清培養(yǎng)基Opti-MEM（即電轉(zhuǎn)Buffer）和DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；牛胰島素購自康朗生物科技（上海）有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自德國Qiagen公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；酵母提取物、胰蛋白胨和氯化鈉均購自美國Oxiod公司；氨芐青霉素購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 主要儀器

電穿孔儀（NEPA21 Super Electroporator）及 2 mm電轉(zhuǎn)杯購自日本 NEPA GENE 公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計、CO2培養(yǎng)箱和高速冷凍離心機均購自美國 Thermo Fisher Scientific公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；細胞計數(shù)儀購自博大博聚科技（深圳）有限公司；恒溫細菌培養(yǎng)箱購自昕儀儀器儀表（上海）有限公司；恒溫細菌培養(yǎng)搖床購自圣科儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的準備

利用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細胞，并將菌體涂布在LB平板（氨芐青霉素濃度為100 μg/mL）上，37 ℃恒溫細菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素濃度為100 μg/mL）中，37 ℃恒溫細菌搖床中培養(yǎng)過夜，按照質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取擴增后的質(zhì)粒。利用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，A260/A280為 1.8～1.9，測得質(zhì)量濃度為 1.176 μg/μL。

1.2.2 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

從液氮罐中取出裝有MCF-7細胞的凍存管，于37 ℃水中搖晃融化，加 4～5 mL DMEM 培養(yǎng)基混勻，1 000 r/min 離心 4 min，棄上清，加 1～2 mL 培養(yǎng)基重懸細胞，接種于 T25培養(yǎng)瓶中，加含 10% FBS、0.01 mg/mL牛胰島素的 DMEM 培養(yǎng)基 6～8 mL，于 37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換液 1次，每2～3 d按1∶4比例傳代1次。

1.2.3 MCF-7細胞的電轉(zhuǎn)染

融合度為80%～90%的MCF-7細胞在經(jīng)0.25%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化完全后，用電轉(zhuǎn)Buffer Opti-MEM重懸細胞2遍以除去消化終止液中的血清，而后用細胞計數(shù)儀計數(shù)。NEPA21電穿孔儀（2 mm電轉(zhuǎn)杯）懸浮電轉(zhuǎn)時，要求100 μL的電轉(zhuǎn)混合液中細胞數(shù)量不低于106個，質(zhì)粒質(zhì)量不少于10 μg。電轉(zhuǎn)染時，將裝有電轉(zhuǎn)混合液的電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)杯腔，按下“Ω”鍵測定電阻值（應(yīng)處于30～50 Ω），按下“start”鍵執(zhí)行電轉(zhuǎn)程序，每組電轉(zhuǎn)程序重復(fù)3次。電轉(zhuǎn)完成后，細胞轉(zhuǎn)入預(yù)熱的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察EGFP表達情況，計算電轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 電轉(zhuǎn)染效率觀察

每組轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞培養(yǎng)48 h后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化收集，制成相同體積的細胞懸液，于熒光顯微鏡下固定1個視野計算出可見光下細胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)換為熒光光源，計算出發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)，按公式1計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 不同條件對細胞轉(zhuǎn)染效率的影響

分別在不同電壓（100 V、125 V、150 V、175 V、200 V）、不同電脈沖次數(shù)（1～4次）、不同電脈沖時長（2.5 ms、5.0 ms、7.5 ms）、不同質(zhì)粒濃度（0.377 μg /μL、0.565 μg/μL、0.778 μg/μL、0.985 μg/μL、1.176 μg/μL）、不同細胞狀態(tài)（傳代后 0 h、24 h、48 h、72 h）條件下對MCF-7細胞進行電穿孔轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，分別計算細胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 19.0軟件對轉(zhuǎn)染效率數(shù)值進行統(tǒng)計分析。相同條件下每組實驗重復(fù)3次，所有組間數(shù)據(jù)都以平均數(shù)±標準差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 電壓對轉(zhuǎn)染效率的影響

當電脈沖次數(shù)為2次，電脈沖時長為5 ms，質(zhì)粒濃度為1.176 μg/μL，按照表1中的電壓值進行電轉(zhuǎn)實驗。由單因素方差分析可知，150 V電壓條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率為66.20%±2.48%；從圖1中可觀察出電壓自100 V增加至150 V時，轉(zhuǎn)染效率呈遞增趨勢，但當電壓升高至200 V時，由獨立樣本t檢驗分析可知，轉(zhuǎn)染效率顯著降低（P＜0.05）。

當電壓自100 V增加至150 V時，細胞膜上形成的瞬時性孔洞不斷增多，MCF-7細胞獲取外源質(zhì)粒DNA的量不斷增大，但當電壓升至175 V和200 V時，電脈沖對細胞的損傷程度較大，細胞死亡率上升，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)染效率下降，從而使MCF-7細胞在150V時具有最大轉(zhuǎn)染效率為（66.20±2.48）%。

表1 不同電壓條件下人乳腺癌細胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖1 不同電壓條件對人乳腺癌細胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.2 質(zhì)粒濃度對轉(zhuǎn)染效率的影響

當電脈沖次數(shù)為2次，電脈沖時長為5 ms，電壓值為150 V，按照表2中的質(zhì)粒濃度進行電轉(zhuǎn)染實驗。由單因素方差分析可知，質(zhì)粒濃度為1.176 μg/μL條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率為66.20%±2.48%；從圖2中可觀察出隨著質(zhì)粒濃度的不斷提高（0.377～0.985 μg/μL），轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)提高，但當質(zhì)粒濃度為1 μg/μL左右（0.985～1.176μg/μL）時，由獨立樣本t檢驗分析可知，質(zhì)粒濃度的變化對細胞轉(zhuǎn)染效率的影響不顯著（P＞0.05），提示電轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒濃度存在飽和性問題，1 μg/μL很可能是其閾濃度。

表2 不同質(zhì)粒濃度條件下人乳腺癌細胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖2 不同質(zhì)粒濃度條件對人乳腺癌細胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.3 電脈沖次數(shù)對轉(zhuǎn)染效率的影響

當電脈沖時長為 5 ms，質(zhì)粒濃度為 1.176 μg/μL，電壓值為150 V，按照表3中的電脈沖次數(shù)進行電轉(zhuǎn)實驗。由單因素方差分析可知，脈沖次數(shù)為2次時獲得最大轉(zhuǎn)染效率66.20%±2.48%；由圖3和獨立樣本t檢驗分析結(jié)果可知，脈沖次數(shù)為2時與1次及3次時的轉(zhuǎn)染效率差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

表3 不同脈沖次數(shù)條件下人乳腺癌細胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖3 不同脈沖次數(shù)對人乳腺癌細胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.4 電脈沖時長對轉(zhuǎn)染效率的影響

當電脈沖次數(shù)為2，質(zhì)粒濃度為1.176 μg/μL，電壓值為150 V，按照表4中的電脈沖時長進行電轉(zhuǎn)實驗。由單因素方差分析可知，脈沖時長為5 ms條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率66.20%±2.48%；由圖4和獨立樣本t檢驗分析結(jié)果可知，脈沖時長為5 ms時與2.5 ms及7.5 ms時的轉(zhuǎn)染效率差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

電脈沖時長過短或電脈沖次數(shù)過少，細胞膜上無法形成或形成的瞬時孔洞不足，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下；電脈沖持續(xù)時間過長或電脈沖次數(shù)過多，電穿孔時產(chǎn)生熱量過多，細胞死亡率升高或后續(xù)培養(yǎng)時失去生物學(xué)功能。電脈沖時長為5 ms，脈沖數(shù)為2次時，電轉(zhuǎn)染MCF-7細胞可獲得最大轉(zhuǎn)染效率。

表4 不同脈沖時長下人乳腺癌細胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖4 不同脈沖時長對人乳腺癌細胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.5 細胞狀態(tài)對轉(zhuǎn)染效率的影響

當電脈沖次數(shù)為2，脈沖時長為5 ms，質(zhì)粒濃度為 1.176 μg/μL，電壓值為 150 V，按照表5中的細胞傳代后培養(yǎng)時間進行電轉(zhuǎn)實驗。由單因素方差分析可知，傳代時間為24 h條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率66.20%±2.48%；由圖5和獨立樣本t檢驗分析結(jié)果可知，傳代時間為24 h時與48 h及72 h時的轉(zhuǎn)染效率差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

表5 不同細胞狀態(tài)下人乳腺癌細胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖5 不同細胞狀態(tài)對人乳腺癌細胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在電壓150 V、質(zhì)粒濃度1 μg/μL左右、脈沖數(shù)2次、脈沖時長5 ms、傳代時間 24 h時，電穿孔人乳腺癌細胞MCF-7可獲得最大轉(zhuǎn)染效率。本研究通過優(yōu)化MCF-7細胞的電轉(zhuǎn)染條件，顯著提高了MCF-7細胞的轉(zhuǎn)染效率，為MCF-7細胞株的相關(guān)基礎(chǔ)研究和乳腺癌臨床靶向治療提供了實驗參數(shù)。