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        Y2O3:Yb,Er納米粒子的制備及生物學(xué)表征

        2020-03-07 04:59:44汪沁齊嘉欣溫金熙周興平
        生物化工 2020年1期
        關(guān)鍵詞:活性劑粒徑粒子

        汪沁,齊嘉欣,溫金熙,周興平

        (東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620)

        近年來,上轉(zhuǎn)換熒光材料由于具有新穎的光學(xué)和化學(xué)性質(zhì),其合成研究引起了廣泛的關(guān)注[1-2]。氧化釔(Y2O3)是一種很有前途的上轉(zhuǎn)換材基質(zhì),其在摻入Yb3+和Er3+離子后,可以表現(xiàn)出很強的熒光性質(zhì)。制備這種材料的方法多種多樣,包括溶膠-凝膠法[3]、固相法[4]、共沉淀法[5]、水熱法[6]和燃燒法[7]。一般情況下,使用水熱法進行制備,再煅燒生成產(chǎn)物。但是,Y2O3納米材料還存在一些有待解決的問題,如制備時所需的煅燒溫度較高[8]、由氫氧化物制備氧化物的情況居多[9-10]、會使反應(yīng)物有殘留、產(chǎn)物不純以及光穩(wěn)定性不佳等,使其在實際應(yīng)用中受限很大。此外,納米材料有很多傳統(tǒng)的微米尺寸熒光材料沒有的優(yōu)勢,這些性質(zhì)大多數(shù)與顆粒的大小等性質(zhì)密切相關(guān)。通過改變某些反應(yīng)條件,會對化合物的各種性質(zhì)產(chǎn)生影響。因此,有必要對納米發(fā)光材料的制備過程進行優(yōu)化,以得到各種應(yīng)用中所需要的不同性質(zhì)的納米粒子。

        目前,Y2O3已經(jīng)應(yīng)用于很多領(lǐng)域,例如陶瓷[11]、半導(dǎo)體[12]、催化劑[13]和生物探針[14]等。已有研究表明Y2O3上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料可以用于骨修復(fù)材料[15],且Y2O3:Yb,Er納米粒子有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性,說明Y2O3:Yb,Er在生物學(xué)有潛在的應(yīng)用價值。而細胞和Y2O3:Yb,Er納米粒子之間的生物相容性是納米粒子應(yīng)用于生物學(xué)的重要參數(shù)。因此,研究其生物學(xué)性質(zhì)具有很深遠意義。

        本文以硝酸釔和尿素為主要原料,用水熱-煅燒兩步法對制備Y2O3:Yb,Er納米粒子的條件進行優(yōu)化,得到最優(yōu)條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子,并對其進行了生物學(xué)性質(zhì)探究,為其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一些依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        尿素(AR,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);硝酸釔(AR,阿拉丁試劑有限公司);硝酸鐿(AR,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司);硝酸鉺、十六烷基三甲基溴化銨(AR,阿達瑪斯試劑有限公司);無水乙醇(AR,常熟市楊園化工有限公司)。

        Nano-ZS納米粒度與電位分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;Avatar380紅外光譜儀,美國熱電集團;D/max-2550PC X射線粉晶衍射光譜儀,日本Rigaku;FLS-1000熒光光譜儀,天美科學(xué)儀器有限公司;JSM-5600LV場發(fā)射掃描電鏡,日本JEOL;酶標儀,Multiskan Sky;SP8 共聚焦熒光顯微鏡,德國 Leica。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 Y2O3:Yb,Er納米粒子的制備

        室溫下,將 0.319 2 g 硝酸釔、0.086 2 g 硝酸鐿和0.006 9 g硝酸鉺溶于30 mL去離子水中,再將0.182 2 g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和1.201 2 g尿素加入去離子水中繼續(xù)溶解。然后將此溶液倒入反應(yīng)釜中,水熱法在160 ℃下反應(yīng)3 h;冷卻后取出,用去離子水和乙醇反復(fù)洗滌,然后離心、干燥。最后將所得產(chǎn)物在600 ℃下煅燒2 h后得到Y(jié)2O3:Yb,Er粉末。

        改變水熱法反應(yīng)物溫度(130~200 ℃,10 ℃一個梯度),得到不同溫度條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子。

        用吐溫80取代CTAB作為表面活性劑,或不添加表面活性劑,制備Y2O3:Yb,Er納米粒子。

        改變煅燒溫度(200~800 ℃,100 ℃一個梯度),得到不同煅燒溫度條件下的Y2O3:Yb,Er納米粒子。

        1.2.2 細胞毒性實驗

        實驗選用Y2O3:Yb,Er納米粒子為試樣,Hela細胞為受體。將HeLa細胞以每孔5 000個細胞的密度接種在1640培養(yǎng)基(RPMI-1640,含10%FBS)的96孔板中,并生長24 h。添加新鮮培養(yǎng)基中濃度為0.7~200 μg/mL的Y2O3:Yb,Er納米粒子作為替代品,并將細胞孵育24 h。然后除去工作溶液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞兩次。將總計10 μL的CCK-8(Cell Counting Kit-8,BIOMIKY)添加到每個孔中,并將細胞在5%的CO2濕潤的氣氛中于37 ℃進一步孵育 1 h。將板搖動 5 min,并使用酶標儀在 450 nm處測量吸光度。

        1.2.3 細胞成像實驗

        上述說到字幕翻譯一般比較大眾化,有著文化交際的功能。那么,做字幕翻譯一般都是采用簡單易懂的文字,很少涉及到復(fù)雜難懂的表達。再者,由于電影具有瞬時性,每一句臺詞出現(xiàn)的時間實際上是很短暫的,這就要求譯者要將劇情還有角色的情緒在短時間內(nèi)呈現(xiàn)出來,達到一目了然的效果。

        用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),在玻底皿中接種30 000個Hela細胞。將玻底皿置于培養(yǎng)箱中在37 ℃、5% CO2的 條 件 下 培 育 24 h。Hela細 胞 首 先 用Y2O3:Yb,Er納米顆粒(事先用聚乙二醇修飾)在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中染色12 h。用PBS洗皿兩次,然后用4%的多聚甲醛固定20 min,細胞核染料4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,0.08 μg/mL)隨后孵化 30 min。最終用盛著PBS的玻底皿在激光共聚焦熒光顯微鏡下進行成像。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 Y2O3:Yb,Er制備條件的優(yōu)化

        2.1.1 反應(yīng)溫度對Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

        圖1為不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb, Er納米粒子與標準卡片的XRD對比圖。從圖中可以看出,不同溫度下制得的Y2O3:Yb, Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相,證實了Y2O3:Yb, Er納米粒子的形成。

        圖1 不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子XRD圖及與標準卡片的對比

        圖2為不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光譜圖。從圖中可以發(fā)現(xiàn),在130~160 ℃范圍內(nèi),隨著反應(yīng)溫度的升高,Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強度呈現(xiàn)增強的趨勢,160 ℃時,Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強度最強,隨著溫度繼續(xù)升高,Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光強度呈現(xiàn)減弱的趨勢。這可能是因為Y2O3形成之前為帶結(jié)晶水的碳酸釔[16],一般情況下,溫度超過200 ℃后,結(jié)晶水就已經(jīng)完全消失[17]。說明在超過一定溫度時,會破壞前驅(qū)體的結(jié)構(gòu),致使煅燒后產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致熒光強度的降低。

        圖2 不同反應(yīng)溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子熒光圖及最大熒光強度變化趨勢圖

        2.1.2 不同表面活性劑對Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

        圖3為不同表面活性劑下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的與標準卡片的XRD對比圖。從圖中可以看出,不同表面活性劑下制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相,證實了Y2O3:Yb,Er納米粒子的形成。

        圖3 不同表面活性劑下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子的XRD圖及與標準卡片的對比

        圖4為不同表面活性劑下Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光圖譜。從圖中可以看出,發(fā)射峰基本在同一個位置,沒有變化,發(fā)光最強的為以CTAB為表面活性劑制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子,以吐溫80為表面活性劑時發(fā)光強度次之,當(dāng)無表面活性劑時,發(fā)光最弱。因為氧化釔為無機晶體,吐溫80作為非離子表面活性劑,游離在溶液中,難以與溶液中離子相結(jié)合,起到促進反應(yīng)進行的作用。而CTAB為陽離子表面活性劑,可以與溶液中的陰離子結(jié)合,使表面活性劑中的氨基帶上正電荷,促進反應(yīng)進行。同時,加入表面活性劑之后,產(chǎn)物的分散性變好,缺陷較少,導(dǎo)致熒光強度變強。

        圖4 不同表面活性劑條件下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子熒光圖譜及SEM圖:(a)無表面活性劑;(b)吐溫80;(c)CTAB

        圖4中SEM圖通過Nanometer軟件計算得出,未加入表面活性劑時,產(chǎn)物的粒徑為41.0 nm;加入吐溫80時,產(chǎn)物的粒徑為44.7 nm;加入CTAB時,產(chǎn)物的粒徑為46.8 nm。加入表面活性劑之后,產(chǎn)物的粒徑變大。聯(lián)系其發(fā)光性能,可以看出,大的顆粒,晶體的完整性好,發(fā)光能力更強;從無表面活性劑到非離子型表面活性劑再到陽離子型表面活性劑,所形成的顆粒變大,可能與其在正生長的粒子表面的吸附能力差異有關(guān)[18]。

        2.1.3 不同煅燒溫度對Y2O3:Yb,Er納米粒子的影響

        圖5為不同煅燒溫度下制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子與標準卡片的XRD對比圖。從圖中可以看出,不同煅燒溫度下制得的Y2O3:Yb,Er納米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相,證實了Y2O3:Yb,Er納米粒子的形成。

        圖5 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子XRD圖及與標準卡片的對比

        因為在500 ℃之前沒有形成Y2O3,沒有表現(xiàn)出發(fā)光性能,所以只能研究在500~800 ℃不同煅燒溫度下熒光強度的變化。從圖6中可以看出,樣品隨著溫度的升高在600 ℃時表現(xiàn)出最佳的發(fā)光強度,然后隨著溫度的繼續(xù)升高,熒光強度降低??赡苁且驗殡S著樣品的結(jié)晶度降低和缺陷的存在,導(dǎo)致發(fā)光性能降低。

        圖6 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子的熒光譜圖

        對不同煅燒溫度下(200~800 ℃)的產(chǎn)物進行紅外測試分析(圖7),產(chǎn)物經(jīng)500 ℃煅燒2 h后,在1 635 cm-1處 C=O[19]的吸收峰大大減弱。200~800 ℃煅燒后樣品的紅外光譜的峰位置沒有太大變化,強度有所不同。這可能是因為晶粒大小的變化在紅外光譜上體現(xiàn)的不太明顯[20],而表示碳酸的1 522 cm-1處的特征峰[21]和表示C-O的1 365 cm-1處的特征峰[22]的吸收強度先是隨著煅燒溫度的升高而逐漸減弱,到600 ℃以后,吸收峰的強度基本保持不變。這表明,碳酸的量先是隨溫度升高而減少,600 ℃后基本不變,并且吸收強度弱到幾乎沒有,而在562 cm-1處的峰,歸屬于Y2O3中Y-O[23]的特征峰,說明煅燒至600 ℃時前驅(qū)體已經(jīng)完全轉(zhuǎn)變?yōu)閅2O3,表明已經(jīng)生成了Y2O3。

        圖7 不同煅燒溫度下Y2O3:Yb,Er納米粒子紅外光譜

        圖8為煅燒前后Y2O3:Yb,Er納米粒子的掃描電鏡圖(SEM),粒徑測試結(jié)果為煅燒前平均粒徑50.5 nm,煅燒后平均粒徑32.85 nm,煅燒后粒子大小比前驅(qū)體小,且煅燒前后納米粒子的形態(tài)良好。說明煅燒后Y2O3:Yb,Er納米粒子也能保持一個良好的形態(tài)。

        圖8 煅燒前(a)和煅燒后(b)Y2O3:Yb,Er納米粒子的SEM圖以及粒徑圖

        2.2 Y2O3:Yb,Er納米粒子的生物學(xué)表征

        2.2.1 Y2O3:Yb,Er的細胞毒性實驗

        圖9為細胞孵育24 h后的細胞活性圖,很直觀地揭示了Y2O3:Yb,Er納米粒子的細胞毒性。分析對照組和空白組可知,當(dāng)Y2O3:Yb,Er的濃度高于200 mg/mL時,細胞存活率依然大于85%。與傳統(tǒng)的熒光標記物如有機染料、半導(dǎo)體量子點相比,Y2O3:Yb,Er納米粒子的毒性很小,體現(xiàn)出良好的生物相容性,說明Y2O3:Yb,Er對細胞的損傷較小。

        圖9 不同濃度Y2O3:Yb,Er對細胞存活率的影響

        2.2.2 Y2O3:Yb,Er的細胞成像實驗

        圖10(a)是DAPI染色的細胞核,圖10(b)是Y2O3:Yb,Er納米粒子在 980 nm 激發(fā)下,500~800 nm范圍內(nèi)的熒光圖像,圖10(d)是將圖10(a)和圖10(b)結(jié)合在一起的圖片,從圖10(d)中可以看出Y2O3:Yb,Er納米粒子已經(jīng)被細胞吞噬,并包裹在細胞核周圍,說明Y2O3:Yb,Er納米粒子有良好的的生物相容性,可以應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域。

        圖10 Y2O3:Yb,Er的細胞成像圖:(a)DAPI,0.08 mg/mL;(b)Y2O3:Yb,Er熒光偽彩圖像(500~800 nm),980 nm激發(fā);(c)明場圖片:(d)a和b的合并圖像

        3 結(jié)論

        用水熱-煅燒兩步法制備的Y2O3:Yb,Er納米粒子平均粒徑為32.85 nm。Y2O3:Yb,Er納米粒子在600 ℃煅燒下?lián)碛辛己玫木秃桶l(fā)光強度,比一般文獻中報道的煅燒溫度都低。此外,Y2O3:Yb,Er納米粒子幾乎沒有細胞毒性,并且具有很好的生物相容性,這對Y2O3:Yb,Er納米粒子在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的價值。

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