安健健, 管鑫, 姜相君, 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)二科 山東省青島市 266000

李思源, 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院普外一科 山東省青島市266000

徐曉娜, 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院中心實驗室 山東省青島市266000

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一種死亡率高的常見惡性腫瘤, 根據(jù)最新全球癌癥統(tǒng)計報告分析, GC位居全球常見腫瘤第五位, 成為癌癥死亡的第三大原因[1]. 在我國,GC發(fā)病率和死亡率分別排名第二位和第三位[2]. GC的發(fā)病機制十分復(fù)雜, 其發(fā)生發(fā)展過程是多因素共同作用、長期積累的結(jié)果, 基因組學(xué)[3]、表觀基因組[4]、代謝組學(xué)[5]等多方面仍在不斷探索. 目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的GC普查方法, 內(nèi)鏡篩查也尚未普及, 即使在GC發(fā)病率高的日本、韓國等發(fā)達(dá)國家[6], 且早期GC無特殊臨床癥狀, 多數(shù)GC患者確診時為進(jìn)展期, GC的5年生存率僅為30%-35%[7], 迫切需要探索新的分子標(biāo)志物協(xié)助GC診斷及預(yù)后判斷, 非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)、蛋白質(zhì)編碼RNA是重要的功能調(diào)節(jié)分子, 介導(dǎo)多種細(xì)胞過程的, 參與多種疾病發(fā)生發(fā)展過程, 尤其是癌癥基因調(diào)控過程[8,9]. 長鏈ncRNA母源性表達(dá)基因3(long ncRNA MEG3, lncRNA MEG3)在GC組織中表達(dá)下調(diào), 抑制GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲, 在GC發(fā)生中起重要的調(diào)控作用[10]. 與MEG3共享DLK1-DIO3位點的母源性表達(dá)基因8(maternally expressed gene 8, MEG8)在GC方面尚未有研究報道. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族, 以其催化轉(zhuǎn)酰胺或交聯(lián)反應(yīng)的能力為依據(jù)[11], 被廣泛研究并發(fā)現(xiàn)其在多種疾病中發(fā)揮作用. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2, TGM2)可以促進(jìn)或抑制細(xì)胞死亡, 參與多種生理及病理過程,可誘導(dǎo)具有肽交聯(lián)活性的腫瘤抑制因子降解, 參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程[12,13]. TGM2與GC患者預(yù)后間的關(guān)系需進(jìn)一步證實. 本研究旨在通過檢測 MEG8、TGM2在GC組織中的表達(dá), 分析其在組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 材料 收集自2018-01/2019-01于我院普外科收治的30例GC患者的手術(shù)切除的GC組織及癌旁組織標(biāo)本, 癌旁組織取距離癌變邊緣≥5 cm處. 患者術(shù)前均未行放化療, 病歷資料完整, 男性19例, 女性11例; 年齡44-85歲, 平均年齡66.9歲, Ⅰ期4例, Ⅱ期14例, Ⅲ期9例, Ⅳ期4例; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例, 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例; 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移4例, 無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移26例. 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中摘錄來自Chen的GC研究數(shù)據(jù)(http://smd.stanford.edu/cgibin/publication/viewPublication.pl?pub_no=232), 展示了mRNA TGM2在29例胃正常黏膜、65例GC組織中的表達(dá)情況, 并根據(jù)所包含的85例GC患者隨訪數(shù)據(jù), 分析TGM2表達(dá)與患者生存時間的關(guān)系. 本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(表1).

1.2 方法 組織樣本RNA提取和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測: 采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取GC組織標(biāo)本中總RNA. 參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent KIt with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說明書, 將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 在20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入不超過1 μg總RNA進(jìn)行cDNA 的合成. qRT-PCR使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)取2 μL cDNA 作為模板, lncRNA MEG8引物序列: 5’-TCCATGGCCACCAGCCTTA-3’; 5’-GG AACACAACAATCTTGATCCCAAC-3’, mRNA TGM2引物序列: 5’-CCCAGCAGGGCTTTATCTACCA-3’;5’-GCAGATGTCTAGGATCCCATCTTCA-3’引物濃度0.5 μmol/L, 20 μL體系進(jìn)行擴增, 根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計合成相應(yīng)上、下游引物進(jìn)行PCR擴增, 以GAPDH作為內(nèi)參照. PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行. 實驗所得的數(shù)據(jù)運用公式RQ = 2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析. 根據(jù)2-ΔΔCt值的中位數(shù)定義低表達(dá)和高表達(dá), 即表達(dá)量＜2-ΔΔCt中位數(shù), 為低表達(dá), 反之為高表達(dá).

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理. 根據(jù)資料的類型不同, 采用不同的統(tǒng)計學(xué)方法分析,連續(xù)變量采用t檢驗, 分類變量采用χ2檢驗, 有序變量采用回歸分析. 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線, 并行Log-rank檢驗分析結(jié)果.P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 MEG8、TGM2在GC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況 MEG8在30例GC組織中的相對表達(dá)量為0.462±0.082, 明顯低于癌旁組織的1.048±0.149,P＜0.05, 具有統(tǒng)計學(xué)差異; TGM2在GC組織中的相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織(1.202±0.143vs0.742±0.083),P＜0.05, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1、2).

2.2 MEG8、TGM2表達(dá)與GC患者臨床病理特征的關(guān)系 MEG8表達(dá)與性別、腫瘤部位、分化程度、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān),P＞0.05, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義; 而與年齡、臨床分期有關(guān),P＜0.05, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義. TGM2表達(dá)在年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面均未見明顯差異(P＞0.05), 與臨床分期有關(guān), 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表1).

2.3 TGM2在GC及正常胃黏膜中的表達(dá)情況及與患者預(yù)后關(guān)系 數(shù)據(jù)摘自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫, TGM2在GC及正常胃黏膜中的表達(dá)情況如圖3, TGM2在GC組織中的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織, 有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),根據(jù)85例GC患者隨訪數(shù)據(jù)繪制生存曲線如圖4, TGM2表達(dá)情況與GC患者預(yù)后未見明顯差異, 無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05).

3 討論

腫瘤是威脅人類健康的重要原因, 權(quán)威期刊報道, 2018年癌癥新增病例1810萬例, 死亡病例達(dá)960萬, 其中GC新增病例超過100萬例, 估計有78.3萬例死亡[1], 楊之洵等對我國GC發(fā)病趨勢分析, 預(yù)計2020年中國GC發(fā)病率為24.30/10萬, 新發(fā)病例數(shù)約為34.6萬, 其中男性遠(yuǎn)多于女性, 我國各年齡組的GC發(fā)病率已呈現(xiàn)出下降趨勢, 全人群的發(fā)病率增長趨勢也有所緩解, 但仍高于世界平均水平[14]. 手術(shù)、放療、化療是惡性腫瘤傳統(tǒng)的治療方法, 但各有利弊[15], 為延長腫瘤患者的生存時間, 改善生活質(zhì)量, 促使研究人員發(fā)展癌癥治療的新技術(shù)、新方法, 例如: 免疫療法, 研究證實癌癥免疫療法已經(jīng)取得了顯著的臨床療效[16]. 由于GC早期臨床癥狀不明顯, 部分患者被確診為晚期, 且局部腫瘤易侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),中國GC 5年生存率僅為35.9%[17]. 因此, 對GC發(fā)生發(fā)展的分子機制研究是十分有必要的, 有助于GC的早期診斷及治療.

在人類基因組中占多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本不編碼蛋白質(zhì),即ncRNA, 被認(rèn)為是解決疾病中基因失調(diào)的關(guān)鍵[18,19].長度＞200 nt的ncRNA被稱為lncRNA[20], 參與多種生物學(xué)過程, 如: 組蛋白修飾, DNA甲基化和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄等[21].lncRNA、mRNA在GC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮其功能多樣性, 例如: lncRNA GASL1通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制GC細(xì)胞的增長[22]; lncRNA FLVCR1-AS1通過競爭性結(jié)合miR-155促進(jìn)c-myc表達(dá), 通過FLVCR1-AS1-miR-155-c-Myc信號通路在GC中發(fā)揮癌基因的作用[23]. 抑制性κB激酶(inhibitory κB kinases, IKKS)和抑制性NF-κB激酶亞基ε的抑制因子(suppressor of IKKε,SIKE)的mRNA表達(dá)與GC的預(yù)后有著獨特的關(guān)系, 可作為GC預(yù)后的有價值的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點[24].lncRNA、mRNA均可均可從血液、組織等臨床樣本中檢測, 可作為早期診斷標(biāo)志物; 表達(dá)差異可能與腫瘤分期、腫瘤類型等方面相關(guān), 可用于判斷預(yù)后; 可作為治療靶點, 以對抗癌癥進(jìn)展[25], 為腫瘤的診斷、治療、預(yù)后提供了新思路、新方向.

表1 母源性表達(dá)基因8與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2在30例胃癌患者癌及癌旁組織的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n = 15)

圖1 母源性表達(dá)基因8在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況. MEG8:母源性表達(dá)基因8.

圖2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況. TGM2: 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2.

圖3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2在胃癌及正常胃黏膜中的表達(dá)情況(數(shù)據(jù)摘自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫). TGM2: 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2.

圖4 生存曲線，（n = 85）.

MEG8與MEG3共享DLK1-DIO3位點, 位于染色體14q32.3上. DLK1-DIO3印記區(qū)包括長鏈非編碼RNA(MEG3、MEG8、MEG9和Linc00524)、miRNA、蛋白質(zhì)編碼基因等[26]. DLK1-DIO3簇某些組分的改變與疾病病理過程有關(guān)[27], 相關(guān)研究已證實, DLK1-DIO3簇某些蛋白編碼基因參與肺癌及肝癌的發(fā)生過程; miRNA參與了不同腫瘤的發(fā)展, 如淋巴瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃腫瘤等[28]. MEG3被認(rèn)為是一個非常重要的抑癌基因, 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[29], 在肺癌、肝癌、GC、宮頸癌、結(jié)腸癌中表達(dá)下降, 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和化療耐藥有關(guān)[29]. 最近研究顯示, 在肺癌及胰腺癌細(xì)胞株中, lncRNA MEG8參與轉(zhuǎn)化生長因子-β介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchy maltransition,EMT)過程, 對表觀遺傳EMT的誘導(dǎo)有顯著的促進(jìn)作用[30];LncRNA MEG8通過競爭性結(jié)合miR-181a-5p促進(jìn)PPARα蛋白表達(dá), 調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖, 遷移和凋亡, 在血管動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用[31]; 差異性表達(dá)的lncRNA MEG8可能在病理性新生血管生成過程中起到重要調(diào)控作用, 可能參與嬰幼兒血管瘤的血管生成[32].但是目前l(fā)ncRNA MEG8在GC方面尚無研究報道. 本研究通過測定lncRNA MEG8在GC組織與其對應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)量, 分析了兩組間表達(dá)差異情況及與臨床病理因素相關(guān)性, 結(jié)果顯示lncRNA MEG8在GC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);MEG8的表達(dá)與患者年齡及臨床分期相關(guān)(P＜0.05), 臨床分期越高, MEG8在GC組織中的相對表達(dá)越低, 以上研究結(jié)果提示MEG8可以作為GC診斷的潛在靶點, 為GC診斷提供新思路.

mRNA TGM2是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族成員之一, 通過鈣依賴性?；D(zhuǎn)移反應(yīng)(轉(zhuǎn)酰胺化)催化蛋白質(zhì)的特異性翻譯后修飾. 此外, 該酶顯示出多種酶活性, 例如鳥嘌呤核苷酸結(jié)合和水解、蛋白激酶、二硫鍵異構(gòu)酶活性, 并參與細(xì)胞粘附. 是參與腫瘤發(fā)生各個階段的關(guān)鍵酶之一. 在癌癥干細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化, 細(xì)胞凋亡、分化以及侵襲性轉(zhuǎn)移表型形成中起重要作用[33]. 已有研究顯示TGM2在消化道腫瘤中發(fā)揮重要作用, TGM2通過的Wnt/β-catenin的通路調(diào)節(jié)血管生成, 干擾結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[34]. TGM2在GC血管內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào), 新型肽GX1可以通過直接結(jié)合TGM2抑制血管生成, 從而抑制其下游途徑(NF-κB/HIF1α)[35]. TGM2在食管腺癌中過表達(dá), 并與腫瘤分期分化相關(guān)[36]. 本實驗檢測TGM2在GC及癌旁組織中表達(dá)具有顯著差異, TGM2在GC組織中的相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P＜0.05), 表達(dá)差異與GC分期相關(guān), 與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān). TGM2在GC及癌旁組織表達(dá)差異結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫中其在GC及正常胃黏膜組織的表達(dá)差異性相似, 并分析85例GC患者TGM2的表達(dá)情況與患者生存時間的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)隨訪時間超過30個月時, TGM2高表達(dá)患者的生存率較低表達(dá)患者略高, 但無統(tǒng)計學(xué)差異(P= 0.607,P＞0.05). 有研究表明高表達(dá)的TGM2是腫瘤存活的一個因素[37], 本次研究結(jié)果并沒有體現(xiàn), 由于本研究納入樣本量較小, 需要進(jìn)一步行大樣本研究進(jìn)行驗證. 綜上所述, TGM2在GC組織中的表達(dá)相對癌旁組織明顯升高, 可作為GC診斷潛在分子標(biāo)志物, 其表達(dá)情況對于GC患者預(yù)后意義有待進(jìn)一步大樣本統(tǒng)計研究.

本研究仍存在不足, 因為包括的患者例數(shù)相對偏少, 基因相對表達(dá)量離散程度較大, 初步獲得的結(jié)果可能并不能準(zhǔn)確反映其在GC中的表達(dá)情況, 需要在大樣本中重復(fù)驗證; 其次, 本次實驗僅局限于組織表達(dá)分析,未能體現(xiàn)細(xì)胞及動物層面研究, 基因在GC中的作用機制需進(jìn)一步實驗完善驗證. 近年來雖然GC發(fā)生率較前有所改善, 但由于中國人口基數(shù)大, 且GC初期臨床癥狀不典型, 仍面臨巨大的癌癥防治壓力, 迫切需要發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)志物, 為GC的防治提供機會.

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer, GC)是世界范圍內(nèi)的一種重要癌癥,盡管在過去幾十年中GC事件的發(fā)生率有所下降, 成為第五位最常見的癌癥, 依然是影響全球健康的一個主要問題. 2018年GC新增病例超過100萬例, 估計有78.3萬例死亡, 成為全球第三大與癌癥相關(guān)的死亡原因. 新病例確診后5年存活率僅達(dá)28.3%. GC是一個多方面因素綜合作用、長期積累的最終結(jié)果, 這一發(fā)生發(fā)展過程甚至需要經(jīng)過幾十年, 其發(fā)病機制涉及許多基因、分子信號通路及表觀遺傳學(xué)變化. 從分子水平上了解GC相關(guān)基因表達(dá)水平及調(diào)控模式是十分有必要的, 結(jié)合現(xiàn)在熱門的基因靶向治療理念, 將對GC的診斷、治療以及預(yù)后等方面提供重要依據(jù).

實驗動機

本研究主要探究GC與GC相關(guān)基因的表達(dá)及臨床意義.通過閱讀文獻(xiàn)及應(yīng)用生物信息學(xué)分析, 篩選出可能在GC中有表達(dá)意義的分子MEG8及TGM2. 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測基因在GC組織及其癌旁對照組織中的表達(dá)情況, 比較表達(dá)差異性, 進(jìn)一步聯(lián)系臨床因素分析MEG8與GC患者臨床病理因素相關(guān)性, 為GC的診治及預(yù)后研究提供潛在的分子標(biāo)志物.

實驗?zāi)繕?biāo)

由于GC嚴(yán)重威脅人類健康, 且預(yù)后差, 本研究通過實驗檢測相關(guān)基因在GC及其對應(yīng)的癌旁組織的表達(dá)情況,分析基因表達(dá)與GC臨床病理因素相關(guān)性, 以及基因表達(dá)與GC患者預(yù)后相關(guān)情況, 旨在為GC研究通過新生物標(biāo)志物.

實驗方法

收集GC、及癌旁組織標(biāo)本; 待樣本離體后, 立即置入RNA樣本保存液中, 送至實驗室, 置4 ℃冰箱過夜處理后, 置入-80 ℃冰箱凍存; 經(jīng)過組織RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄等過程, 通過PCR檢測MEG8、TGM2表達(dá)量, 統(tǒng)計分析GC組織與癌旁對照組織間存在表達(dá)差異(P＜0.05), 記錄、匯總實驗數(shù)據(jù), 完善患者信息(年齡、性別、腫瘤分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移),運用統(tǒng)計學(xué)方法分析實驗結(jié)果意義所在, 是否與年齡、性別、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等存在關(guān)聯(lián)性, 分析TGM2表達(dá)與GC預(yù)后的關(guān)系及意義.

實驗結(jié)果

本篇論文實驗結(jié)果基本符合假設(shè)目標(biāo), 通過檢測基因在GC及癌旁組織中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)MEG8在GC組織中表達(dá)低于癌旁組織, 可能成為GC診斷潛在靶點; TGM2在GC組織表達(dá)高于癌旁組織, 但并未發(fā)現(xiàn)TGM2表達(dá)與GC患者預(yù)后情況有顯著意義.

實驗結(jié)論

本次研究首次發(fā)現(xiàn)MEG8在GC及癌旁組織中表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異, 發(fā)現(xiàn)MEG8、TGM2在GC組織中表達(dá)與GC臨床分期具有相關(guān)性, 可能為GC診治及預(yù)后提供潛在生物標(biāo)志物.

展望前景

本研究初步探討MEG8在GC及癌旁組織中具有表達(dá)差異性, 但其在GC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制尚不清楚, 急需進(jìn)一步實驗研究證明, 為GC的診治提供新的研究思路及靶點; TGM2在GC發(fā)生機制已有相關(guān)研究, 其表達(dá)情況與GC患者預(yù)后相關(guān)性需收集大樣本進(jìn)一步統(tǒng)計分析, 為GC預(yù)后提供判斷依據(jù).