龔菊, 黃堅(jiān), 徐若欣, 吳云, 陳煒, 唐兆芳, 樂萍, 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診內(nèi)科 江蘇省蘇州市 215006

龔菊, 常熟市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 江蘇省常熟市 215500

滿益伍, 貴州省石阡縣醫(yī)院急診科 貴州省銅仁市 555100

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一種急診常見的急腹癥, 近年來, 不健康的飲食和生活習(xí)慣, 使得AP發(fā)病率呈逐年上升, 嚴(yán)重危害廣大人民群眾生命健康.目前AP根據(jù)臨床指征[1,2], 可分三種類型: 輕度急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)、中度急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis, MSAP)以及重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP), 三類AP預(yù)后各不相同, 治療方案也有較大差異. MAP具有自限性, 預(yù)后好; 然而, SAP進(jìn)展迅速, 死亡率高, 需及時收住ICU治療, 通過加強(qiáng)護(hù)理、臟器功能支持、液體復(fù)蘇以及消化道黏膜屏障保護(hù)等措施積極治療, 方能提高生存率; 因此, SAP臨床特征的早期識別, 尤為重要. 現(xiàn)認(rèn)為AP發(fā)病機(jī)制主要涉及胰酶激活、炎癥反應(yīng)、免疫失衡、微循環(huán)障礙等多方面, 其中免疫炎癥因子和相關(guān)免疫細(xì)胞至關(guān)重要, 由此, 炎癥細(xì)胞和新炎癥免疫因子檢測在AP鑒別診斷中呈現(xiàn)較高臨床價值.

本研究將以CD14和CD16兩個分子標(biāo)記的外周血單核細(xì)胞分為兩個主要的亞群: CD14+CD16+單核細(xì)胞以及CD14+CD16-單核細(xì)胞, 且兩者在生物學(xué)功能方面具有較大的差異[3]. CD14+CD16+單核細(xì)胞成熟度較高, 且具有較強(qiáng)的抗原遞呈能力, 在炎癥性疾病中通常升高, 曾作為新生兒敗血癥的診斷指標(biāo)[4]. B7-H2是新型共刺激分子, 在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能, 然而該分子在CD14+CD16+單核細(xì)胞表達(dá)情況尚未見報道. 本文旨在探討新型共刺激分子B7-H2在AP患者外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞表達(dá)特征和臨床意義.

1 材料和方法

1.1 材料 經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一院倫理委員會知情同意,依據(jù)2013年中國急性胰腺炎診治指南[1], 選擇蘇州大學(xué)附一院急診住院2016-01/2017-12發(fā)病24 h內(nèi)的AP患者63例, 52.60歲±12.21歲, 男37人, 女26人. 其中MAP患者25例(52.24歲±12.34歲; 男14人, 女11人); MSAP患者為20例(52.61歲±13.45歲; 男12人, 女8人); 以及SAP患者為18例(53.11歲±11.25歲; 男11人, 女7人). 按病因分類,包括膽源性胰腺炎患者29例(MAP, MSAP以及SAP分別為12例, 9例以及8例); 酒精性胰腺炎11例(MAP, MSAP以及SAP分別為5例, 4例以及2例); 高脂性患者9例(MAP, MSAP以及SAP分別為3例, 3例以及3例); 暴飲暴食患者7例(MAP, MSAP以及SAP分別為2例, 2例以及3例)以及其他類型患者7例(MAP, MSAP以及SAP分別為3例, 2例以及2例). 同時, 收集健康體檢者20例作為對照組, 年齡范圍為51.3±14.2歲, 其中男性11例, 女性9例.所有受試者均除外傳染病、腫瘤、自身免疫病、血液病等疾病. 本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)[2017倫審(申報)批第0056號], 并且所有研究對象均簽署知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集與處理: 分別于發(fā)病24 h、48 h以及72 h收集AP患者外周靜脈血, 并以蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心健康人群外周靜脈全血作為對照組(healthy control, HC). 采集標(biāo)本均室溫保存, 并在6 h內(nèi)開始檢測.

1.2.2 流式檢測: 儀器與材料: CytomicsTM FC 500流式細(xì)胞儀(德國); 抗體來自Biolegend公司(美國). 檢測方法: 靜脈外周血標(biāo)本與anti-CD14抗體(PC5標(biāo)記)、anti-CD16抗體(FITC標(biāo)記)聯(lián)合B7-H2抗體(PE標(biāo)記)或同型對照(PE標(biāo)記), 冰上孵育反應(yīng)30 min后, 加入紅細(xì)胞裂解液(Biolegend, 美國)1ml, 37 ℃溫育震蕩反應(yīng)5-10 min至反應(yīng)體系清澈透明; 加入2 mL PBS充分洗滌, 去除細(xì)胞碎片以及未結(jié)合的游離抗體; 以CD14+CD16+組合圈門,檢測分析CD14+CD16+細(xì)胞亞群上B7-H2表達(dá)情況. 所購抗體均來自Biolegend公司(美國).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn), 以mean±SD表示; 兩組均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn); 多組均數(shù)比較采用one-way ANOVA及LSDt檢驗(yàn);P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 所有檢驗(yàn)均為雙側(cè), 統(tǒng)計(jì)軟件為IBM SPSS Statistics 21.

2 結(jié)果

2.1 AP患者CD14+CD16+細(xì)胞膜B7-H2的表達(dá) 健康組CD14+CD16+細(xì)胞膜B7-H2幾乎不表達(dá), AP組發(fā)病24 h CD14+CD16+細(xì)胞膜B7-H2出現(xiàn)異常高表達(dá)(P＜0.001);流式檢測AP和健康對照外周血CD14+CD16+細(xì)胞膜上B7-H2表達(dá)情況, AP患者(n= 63)以及健康對照(n= 20)外周血CD14+CD16+細(xì)胞膜上B7-H2水平統(tǒng)計(jì)圖, 每一個dot代表一個case, 數(shù)據(jù)表示為Mean±SE, 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為unpairedttest. AP患者組以及健康組對比(267.29±104.02, 8.06±3.60;t= 11.10,P＜0.001)(圖1).

2.2 CD14+CD16+和CD14+CD16-細(xì)胞膜B7-H2在不同程度AP患者中的表達(dá) 分析發(fā)現(xiàn), SAP組CD14+CD16+和CD14+CD16-細(xì)胞mB7-H2表達(dá)(373.30±89.72和78.62±13.05)最高, MSAP組(279.55±76.95/44.92±12.44)其次, 均高于MAP組(181.15±35.75/23.32±4.28), 各組兩兩比較差異有顯著性(P＜0.01)(表1、表2), 并且發(fā)現(xiàn)AP各組mB7-H2在CD14+CD16+細(xì)胞膜上表達(dá)明顯高于CD14+CD16-細(xì)胞膜上表達(dá)(P＜0.01).

表1 不同時間點(diǎn)急性胰腺炎各組外周血CD14+CD16+細(xì)胞膜B7-H2值的比較

表2 不同時間點(diǎn)急性胰腺炎各組外周血CD14+CD16-細(xì)胞膜B7-H2值的比較

圖1 急性胰腺炎和健康組外周血CD14+CD16+細(xì)胞膜上B7-H2表達(dá)分析. AP: 急性胰腺炎; HC: 健康組.

2.3 不同時間點(diǎn)AP患者血清中B7-H2的差異表達(dá)MAP組、MSAP組發(fā)病24 h、48 h、72 h CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細(xì)胞膜B7-H2動態(tài)表達(dá)差異無顯著性(P＞0.05); 然而, SAP組無論CD14+CD16+還是CD14+CD16-細(xì)胞膜B7-H2表達(dá)24 h、48 h、72 h均呈明顯上升趨勢, CD14+CD16+細(xì)胞膜B7-H2在不同時間點(diǎn)表達(dá)結(jié)果分別為373.30±89.72、480.49±103.85、641.01±137.00(P＜0.05), CD14+CD16-細(xì)胞膜B7-H2分別為78.62±13.05、90.07±12.24、119.41±15.31(P＜0.05).

3 討論

AP發(fā)病機(jī)制尚不十分明確. 研究顯示, 其發(fā)病始于胰腺損傷胰酶激活, 繼發(fā)炎癥反應(yīng), 從局部適度炎癥因子釋放, 機(jī)體保護(hù)性反應(yīng), 演變?yōu)槭Э匮装Y細(xì)胞激活連鎖反應(yīng), 炎癥介質(zhì)“呈瀑布樣”釋放, 導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammation response syndrome, SIRS),機(jī)體損害, 最終免疫功能紊亂以及代償性抗炎反應(yīng)綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS), 引發(fā)多器官功能障礙, 為AP死亡的主要原因.當(dāng)SIRS和CARS同時并存又相互加強(qiáng), 則產(chǎn)生對機(jī)體更嚴(yán)重的損傷, 導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和免疫功能更嚴(yán)重障礙, 稱為混合型抗炎反應(yīng)綜合征[5]. 因此, 炎癥細(xì)胞與炎癥因子所誘導(dǎo)的免疫功能紊亂失衡, 直接與AP嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián), 決定患者預(yù)后[6].

單核細(xì)胞是一群可塑性極強(qiáng)的髓源性細(xì)胞, 在不同病理?xiàng)l件下可以分化為不同的亞群. CD14+CD16+單核細(xì)胞群體是一群新鑒定的單核細(xì)胞亞群[3]. 該群細(xì)胞主要表現(xiàn)為在炎癥刺激下可以釋放當(dāng)量的腫瘤壞死因子-α,而較少產(chǎn)生白介素-10, 因此該群細(xì)胞被稱為促炎反應(yīng)性單核細(xì)胞[4]. 既往研究中發(fā)現(xiàn)[7,8], 該群細(xì)胞在感染和炎性疾病中均大量增加, 并且發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能.

共刺激分子是一群重要的免疫調(diào)節(jié)分子, 主要表達(dá)在樹突細(xì)胞、B細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞上, 其相應(yīng)的受體集中表達(dá)于T淋巴細(xì)胞. 共刺激分子作為第二信號, 在介導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞刺激T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用, 其直接決定了免疫應(yīng)答的方向和強(qiáng)度. B7-H2是共刺激分子家族新成員[9], 其與配體GL50結(jié)合在介導(dǎo)免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用, 特別是在炎性疾病中. 然而, 該分子在CD14+CD16+單核細(xì)胞上的表達(dá)特征并不清楚. 本論文以急性胰腺炎患者為研究對象, 通過比較分析, 發(fā)現(xiàn)B7-H2在CD14+CD16+單核表達(dá)強(qiáng)度與AP疾病進(jìn)展和分型相關(guān).

關(guān)于B7-H2在急性胰腺炎患者體內(nèi)的表達(dá), 本研究團(tuán)隊(duì)曾率先報道[10]sB7-H2在AP患者血清中表達(dá)量明顯增加, 且與AP的嚴(yán)重程度呈正相關(guān), 由此推測B7-H2可能參與AP的發(fā)生發(fā)展. 為證實(shí)此推論, 本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步檢測AP患者外周靜脈血CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細(xì)胞膜B7-H2表達(dá), 結(jié)果顯示AP發(fā)病24 h CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細(xì)胞膜B7-H2 表達(dá)明顯升高, 健康組幾乎不表達(dá); CD14+CD16+和CD14+CD16-細(xì)胞mB7-H2表達(dá), SAP組表達(dá)最高, 其次MSAP組, 均高于MAP組; 動態(tài)觀察24 h、48 h、72 h B7-H2表達(dá), ,MAP組、MSAP組發(fā)病無顯著差異, 而SAP組呈明顯上升趨勢; 由此, 可以看出CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細(xì)胞膜B7-H2表達(dá), 不僅和炎癥相關(guān), 而且和AP早期嚴(yán)重程度密切相關(guān), 與較前研究[10]相一致, 特別是SAP患者B7-H2異常動態(tài)增高, 可能預(yù)示全身炎癥反應(yīng)SIRS加重, 炎癥因子瀑布樣釋放, 導(dǎo)致免疫紊亂. AP各組B7-H2在CD14+CD16+細(xì)胞膜上表達(dá)均高于CD14+CD16-細(xì)胞膜, 說明CD14+CD16+細(xì)胞在AP發(fā)病過程中更為活躍[7,8].

綜上所述, 本研究結(jié)果顯示, B7-H2分子在AP患者CD14+CD16+和CD14+CD16-單核細(xì)胞膜上呈高表達(dá), 并且與AP嚴(yán)重程度和進(jìn)展相關(guān), 其在CD14+CD16+細(xì)胞表面表達(dá)更為活躍. 但關(guān)于其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索, 可為進(jìn)一步認(rèn)識AP免疫應(yīng)答和失衡提供新線索, 為AP精準(zhǔn)靶向治療提供參考.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)發(fā)病率逐年升高, 不同分型預(yù)后不同, 嚴(yán)重患者死亡率很高. 目前AP發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明, B7-H2是新型共刺激分子, 在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用, 本研究試圖尋找B7-H2在AP發(fā)生及發(fā)展中的異常表達(dá), 揭示其潛在作用機(jī)制, 為臨床研發(fā)治療藥物或制定治療方案提供依據(jù).

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

本研究主題是揭示新型共刺激分子B7-H2在AP患者單核細(xì)胞CD14+CD16+上的表達(dá)差異. 擬解決的問題是揭示B7-H2與AP發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系, 為進(jìn)一步闡明AP免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)致病機(jī)制提供新方向. 為AP精準(zhǔn)治療尋找新靶點(diǎn)提供理論依據(jù).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究主要目標(biāo)是揭示在單核細(xì)胞表面表達(dá)的膜性B7-H2信號潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的機(jī)制. 為下一步研究其與預(yù)后相關(guān)性, 以及動物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ). 為臨床提高AP治療效果提供參考.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究收集AP患者外周靜脈血, 利用流式檢測方法,檢測分析單核細(xì)胞CD14+CD16+、CD14+CD16-細(xì)胞亞群上B7-H2的表達(dá)情況. 首次驗(yàn)證了新型共刺激分子B7-H2在單核細(xì)胞CD14+CD16+表面的表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究證實(shí)AP患者單核細(xì)胞CD14+CD16+表面B7-H2的表達(dá)升高; 重度AP患者CD14+CD16+、CD14+CD16-表面B7-H2的表達(dá)較中度AP、輕度AP更高, 并且72 h內(nèi), 表達(dá)進(jìn)行性升高.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究在B7-H2在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的基礎(chǔ)上,首次驗(yàn)證了其在AP患者CD14+CD16+、CD14+CD16-單核細(xì)胞上的高表達(dá); 首次提出了該新型共刺激分子在AP患者發(fā)病機(jī)制、免疫調(diào)節(jié)中的作用假設(shè); 為B7-H2與AP致病機(jī)制的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)提供新理論; 為AP精準(zhǔn)靶向治療提供新依據(jù).

展望前景

該研究需使用新鮮血標(biāo)本, 以避免影響細(xì)胞表面分子和抗體的結(jié)合; 未來新型共刺激分子B7-H2有望成為治療的新靶點(diǎn); 但需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.