胡亞丹，常新林，鐘 婷，張賀延昊，蘇 進(jìn)，張園園*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，北京 100049；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，上海 201203)

糖苷酶又稱糖苷水解酶，是水解酶家族中的一大類，也隸屬于糖基酶，是所有可水解糖苷鍵的酶類的總稱。糖苷酶根據(jù)催化作用機(jī)制的不同分為構(gòu)型翻轉(zhuǎn)酶和構(gòu)型保持酶兩種[1]。近年來，隨著糖類物質(zhì)在生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的重要性越發(fā)凸顯，關(guān)于糖苷酶的研究與應(yīng)用也變得越發(fā)重要。糖苷酶的活性一般采用具有生色基團(tuán)的物質(zhì)與糖類形成的綴合物進(jìn)行測定，稱為速率檢測法，目前對(duì)硝基苯基作為發(fā)色基團(tuán)較為常見[2]。隨著工業(yè)社會(huì)的進(jìn)步，能源問題越發(fā)嚴(yán)峻。固定化的太陽能生物質(zhì)能資源是最為豐富的碳來源，其中纖維素占比高達(dá)一半。但是纖維素較難被降解利用，這成為能源發(fā)展的難題。對(duì)硝基苯基纖維二糖苷作為纖維寡糖的結(jié)構(gòu)類似物，廣泛用于專一性測定纖維素系列酶的活性[3]。因此，該酶底物的合成具有較為重要的意義，但其合成工藝鮮有報(bào)道。目前，僅可查閱到一些文獻(xiàn)關(guān)于與其相似結(jié)構(gòu)的化合物的合成[4-6]。本研究通過相轉(zhuǎn)移催化法合成了4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷，可為其高效制備及酶催化機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；78-1磁力攪拌器(江蘇榮華儀器制造廠)；2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；核磁共振儀[1H-NMR (400 MHz)，13C-NMR (125 MHz)，瑞士Bruke公司]。

1.2 試劑 纖維二糖、對(duì)硝基苯酚鈉(美國Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；乙酸酐、二氯甲烷、甲醇、乙醇、濃硫酸(分析純，北京化工廠)；33%的氫溴酸-乙酸溶液、無水乙酸鈉、甲醇鈉、四丁基溴化銨(北京伊諾凱科技有限公司)。

2 方法和結(jié)果

目標(biāo)化合物4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷的合成路線見圖1。

2.1 1,2,3,6,2′,3′,4′,6′-O-八乙酰基纖維二糖(化合物A)的合成 在500 ml圓底燒瓶中加入270 ml(2.86 mol)乙酸酐，冰浴下加入100.00 g(0.29 mol)纖維二糖、100.00 g無水乙酸鈉，常溫?cái)嚢? h，薄層色譜法(TLC)監(jiān)測至反應(yīng)完成。將反應(yīng)液倒入冰水中，析出白色固體，抽濾，冷水洗滌，無水乙醇重結(jié)晶，得白色固體(化合物A)195.41 g，收率98.6%。

圖1 4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷的合成路線Figure 1 Synthetic route of 4-nitrophenyl-β-D-cellobioside化合物A:1,2,3,6,2′,3′,4′,6′-O-八乙?；w維二糖;化合物B:2,3,6,2′,3′,4′,6′-O-七乙?；?α-D-溴代纖維二糖; 化合物C:2,3,6,2′,3′,4′,6′-O-七乙?；?4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷; 化合物D:4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷

2.2 2,3,6,2′,3′,4′,6′-O-七乙?；?α-D-溴代纖維二糖(化合物B)的合成 在1000 ml圓底燒瓶中加入195.41 g (0.29 mol)化合物A、600 ml二氯甲烷、75 ml 33%的氫溴酸-乙酸溶液(0.41 mol)于室溫下攪拌反應(yīng)。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)法監(jiān)測反應(yīng)，4 h后停止攪拌。依次用水、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，分取二氯甲烷層，濃縮后乙醚結(jié)晶，得白色固體(化合物B)142.10 g，收率71.0%。

2.3 2,3,6,2′,3′,4′,6′-O-七乙?；?4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(化合物C)的合成 將142.10 g(0.20 mol)化合物B溶于400 ml二氯甲烷，加入50.00 g(0.31 mol)對(duì)硝基苯酚鈉、23.00 g(0.07 mol)四丁基溴化銨作為相轉(zhuǎn)移催化劑，加入400 ml純水，32 ℃下用恒壓漏斗滴加飽和碳酸鈉溶液使pH值保持在8左右，反應(yīng)10 h。分取二氯甲烷層，減壓濃縮析出淡黃色結(jié)晶。乙醇重結(jié)晶，得白色固體(化合物C)82.08 g，產(chǎn)率54.2%。

2.4 4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(化合物D)的合成 取82.08 g(0.11 mol)化合物C置1000 ml圓底燒瓶中，加入700 ml甲醇，加適量甲醇鈉調(diào)節(jié)pH值至9，室溫下反應(yīng)3 h，TLC監(jiān)測至反應(yīng)完全。冰浴攪拌3 h析出固體，過濾，乙酸乙酯重結(jié)晶，得白色固體(化合物D)48.58 g，產(chǎn)率95.3%。

化合物D的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如下。1H-NMR(500 MHz,D2O) δ: 8.17(d,J=7.5 Hz,2H,Ar-H),7.16(d,J=7.5 Hz,2H,Ar-H),5.21(d,J=7.0 Hz,1H,H-1′),4.70(m,7H,OH;2H,H-2′,H-2″),4.46(d,J=7.5 Hz,1H,H-1″),2.90～3.10(m,10H,H-2′～H-6′,H-2″～H-6″)。13C-NMR(125 MHz,D2O)δ:161.64(C-1″),142.61(C-4″),126.09(C-3″,C-5″),116.45(C-2″,C-6″),102.56(C-1′),99.22(C-1),78.14(C-4),75.98(C-5′),75.47(C-3),75.07(C-5),73.96(C-3′),73.14(C-2′),72.50(C-2),69.44(C-4′),60.56(C-6),59.72(C-6′)。

2.5 4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(化合物D)的純度測定 色譜條件： Prevail C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為甲醇-水(30∶70，V/V)，流速1 ml/min，進(jìn)樣量20 μl，漂移管溫度85 ℃，氮?dú)饬魉? L/min，進(jìn)樣濃度500 μg/ml。

記錄色譜圖和峰面積，用峰面積歸一化法進(jìn)行純度測定，純度約為99.87%。4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(化合物D)的HPLC譜圖見圖2。

圖2 4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(化合物D)的HPLC譜圖Figure 2 HPLC chromatogram of 4-nitrophenyl-β-D-cellobioside(compound D)

3 討 論

3.1 化合物B的合成 由于產(chǎn)物的熱力學(xué)性質(zhì)原因，化合物B的絕對(duì)構(gòu)型為熱力學(xué)穩(wěn)定的α構(gòu)型。該反應(yīng)會(huì)有多種副產(chǎn)物生成，其中最具有代表性的副產(chǎn)物為二糖水解生成的2,3,4,6-O-四乙酰基-α-D-溴代葡萄糖，另外隨著反應(yīng)的繼續(xù)還有可能生成不同位置取代或者多取代的溴代葡萄糖、溴代纖維二糖，所以探索適宜的反應(yīng)條件尤為重要。在化合物B的合成之前，先用1.00 g原料進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選合適的合成條件。通過對(duì)溫度(0 ℃、室溫25 ℃)及時(shí)間(2、4、6 h)的篩選，發(fā)現(xiàn)室溫下反應(yīng)效率較高，反應(yīng)4 h后產(chǎn)率升高不明顯，且副產(chǎn)物開始積累，故選擇室溫反應(yīng)4 h為最佳合成條件。

3.2 化合物C的合成 此步反應(yīng)經(jīng)歷了一個(gè)雙分子親核取代反應(yīng)(SN2)歷程，產(chǎn)物發(fā)生了構(gòu)型的轉(zhuǎn)化(Walden轉(zhuǎn)化)，選擇性地由α構(gòu)型變成了β構(gòu)型。本研究考察了以碘化鉀為催化劑，丙酮-水為溶劑體系進(jìn)行成苷反應(yīng)，20 h未見產(chǎn)物生成。在相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基溴化銨作用下，得到了目標(biāo)產(chǎn)物，反應(yīng)10 h的產(chǎn)率為54.2%。但反應(yīng)過程中需注意使用弱堿碳酸氫鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值，若使用強(qiáng)堿氫氧化鈉則易造成溴代糖變質(zhì)及二糖鏈的水解。另外，反應(yīng)溫度不宜過高，否則易造成溴代糖變質(zhì)。

3.3 化合物D的合成 該反應(yīng)的原理是酯交換反應(yīng)，甲醇鈉作為催化劑，易與水反應(yīng)生成氫氧化鈉而失去醇解能力，所以反應(yīng)過程中應(yīng)保持無水。另外，應(yīng)注意甲醇鈉的用量，使體系pH值控制在9即可，若堿性過強(qiáng)則易造成糖苷鍵及二糖鏈水解。

本研究以較為廉價(jià)的D-八乙酰纖維二糖、對(duì)硝基苯酚鈉為底物，經(jīng)乙酰化、溴代、相轉(zhuǎn)移催化成苷、脫保護(hù)4個(gè)步驟，優(yōu)化溴代纖維二糖制備工藝和成苷反應(yīng)條件，最終簡單、高效地合成了酶底物4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷，可為其進(jìn)一步廣闊應(yīng)用提供原料儲(chǔ)備和技術(shù)支持。