佟碩秋，王 嬙，林宗梅，陶 怡，吳擁軍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

目前，全球性的食品能源危機(jī)威脅著人類的發(fā)展，纖維素作為理想的未被利用的可再生生物資源，吸引了眾多科研人員對纖維素降解進(jìn)行研究[1]。我國作為一個(gè)傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈每年的存量在10億t左右，因纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要組成成分，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易降解，因此利用率極低[2]。纖維素原料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方式主要有物理法、化學(xué)法和生物學(xué)方法。物理法和化學(xué)法由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本較高且有一定的環(huán)境污染，在實(shí)際應(yīng)用中有所限制。自然界中存在眾多高產(chǎn)纖維素酶的真菌與細(xì)菌，因此使用生物法降解纖維素是當(dāng)前利用纖維素資源的研究熱點(diǎn)。

1 纖維素的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

纖維素是一種由葡萄糖組成的天然多聚糖，在自然界中分布最廣泛，不溶于H2O及常見的酸堿，常溫下較穩(wěn)定。特定條件下，可與H2O反應(yīng)，氧橋斷裂并結(jié)合水分子，變成葡萄糖。棉花是最純纖維素來源，纖維素含量在95%以上。纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)之一，與果膠和木質(zhì)素的結(jié)合方式，對植物源食品的品質(zhì)有較大影響。

圖1 纖維素結(jié)構(gòu)

纖維素的分子式為 (C6H10O5)n，其結(jié)構(gòu)主要由微晶體與非晶區(qū)組成(圖1)，不同植物結(jié)晶的程度不同，如苧麻的結(jié)晶度在70%左右，粘膠纖維低于40%。纖維素中的氫鍵排列有序，呈帶狀結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)剛性。晶體結(jié)構(gòu)程度越高，越難被微生物降解。非晶體區(qū)結(jié)構(gòu)相對松散，易被微生物降解。

2 纖維素酶種類及作用機(jī)制

纖維素酶是一類存在于微生物及動(dòng)物體內(nèi)的，能將纖維素降解為單糖或寡糖的復(fù)雜蛋白質(zhì)。目前，用于生產(chǎn)的主要取自真菌和細(xì)菌。葛青[4]等誘導(dǎo)出一株高產(chǎn)纖維素酶木酶，酶活達(dá)4.57 U/mL。王琪[5]篩選出一株黑曲霉 Aspergillusniger- 6MA1，發(fā)酵條件優(yōu)化后酶活可升至47.8 U/mL。

根據(jù)作用方式的不同，纖維素酶主要有內(nèi)切葡萄糖苷酶(C1酶)、外切葡萄糖苷酶(Cx 酶)與 β-葡糖苷酶3類。C1酶首先作用于纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，融解纖維素衍生物或者膨脹部分降解的纖維素，Cx 酶繼續(xù)分解 β-1,4-糖苷鍵，每次酶切下一個(gè)纖維二糖單位，β-葡糖苷酶最終將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖，但該酶的專一性較差[6]。

3 纖維素降解菌

纖維素降解菌主要有真菌、細(xì)菌、放線菌。目前，已分離篩選出大量纖維素降解菌，但能應(yīng)用到工業(yè)降解纖維素的極少[7]。高產(chǎn)纖維素降解酶的真菌多為耐酸菌，在酸性條件下分泌的纖維素酶較多，且為胞外酶，容易從培養(yǎng)液中分離純化酶液，但在堿性條件、缺氧條件及高溫條件下，酶活力下降明顯甚至失去活性。目前，用于工業(yè)化生產(chǎn)的纖維素降解真菌主要有白腐真菌、擔(dān)子菌、里氏木霉等。其中，因里氏木霉能同時(shí)分泌3種不同纖維素酶且活力較高，所以對該真菌的研究最多，分泌纖維素降解酶機(jī)制了解最為完整。

相較真菌不耐堿的缺陷，研究人員發(fā)現(xiàn)在低氧條件、中性條件及堿性條件下，部分乳酸桿菌與芽孢桿菌等能正常分泌高活性纖維素酶[8]。何頌捷[9]等從白酒酒糟中分離出的貝萊斯芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌，其分泌的高活性纖維素酶具有較高降解酒糟纖維素的能力。目前，已發(fā)現(xiàn)多種厭氧細(xì)菌、耐堿細(xì)菌能產(chǎn)生纖維素酶，這兩者在生物降解時(shí)纖維素酶系統(tǒng)的降解機(jī)制與好氧真菌存在差異。在不同溫度、含氧量及 pH 等情

況下，微生物分泌纖維素酶的能力不同，證實(shí)了自然環(huán)境中纖維素酶的廣泛可得性。

真菌分泌的纖維素酶一般為胞外酶，易于純化收集，產(chǎn)酶量大且酶系相較細(xì)菌更為全面，但對環(huán)境依賴性強(qiáng)，適應(yīng)性較差，只適合酸性條件下的工業(yè)應(yīng)用。細(xì)菌分泌的纖維素酶一般為胞內(nèi)酶，較少產(chǎn)胞外酶，提純費(fèi)用高，但在中性和堿性纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)，應(yīng)用較多，因此商用價(jià)值較高[10]。

因工業(yè)生產(chǎn)對特殊條件的要求，產(chǎn)纖維素酶的微生物要能在極端條件(強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等)下正常繁殖。張揚(yáng)[11]從南極菲爾德斯半島分離出4株產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶細(xì)菌，鑒定為節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬。黨佳佳[12]等利用剛果紅水解圈初篩，鹽度梯度馴化，從遼河河口區(qū)蘆葦濕地分離出一株高產(chǎn)酶的耐鹽纖維素降解菌LHK-T3，鑒定屬于貪噬菌屬。

4 酶活測定及應(yīng)用現(xiàn)狀

目前酶活測定方法有單酶活和總酶活測定2種。測定纖維素降解酶的酶活最常用的方法是 DNS(3,5-二硝基水楊酸)測定法，是以纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的還原糖量作為酶活標(biāo)準(zhǔn)，DNS來進(jìn)行測定。DNS 法易受多種因素(反應(yīng)條件、濾紙裁剪、試劑存放的時(shí)間)影響，測定微量結(jié)果時(shí)不精確?？偫w維素酶的酶活測定常用濾紙片降解法，但受濾紙片材質(zhì)影響，不同廠家生產(chǎn)的濾紙片的結(jié)晶度與淀粉含量不同，單位時(shí)間降解所生成的單糖量存在差異。C1酶活測定可用羧甲基纖維素鈉糖化法，但不同生產(chǎn)來源的 CMC-Na 測定同一樣品時(shí)，酶活結(jié)果也有較小差異。Cx 酶活測定采用對硝基酚纖維二糖和微晶纖維素，測定方法復(fù)雜，成本高。β-葡萄糖苷酶的活力測定主要有分光光度法及熒光法，一般選用纖維二糖作為底物[13]。測定高活性纖維素酶的酶活一般用濾紙片崩解法，通過測定纖維素酶酶解濾紙產(chǎn)物中葡萄糖的含量，計(jì)算酶活。消解濾紙片的速度越快，證明酶活力越高[14]。

微生物產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素降解成還原糖，還原糖可作為生產(chǎn)乙醇、丙酮的原料，純化后甚至能作為食物、藥物等。隨著研究工作者分離出越來越多的可用于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)纖維素酶微生物，其應(yīng)用范圍也越來越廣，涉及紡織業(yè)、飼料加工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)及能源工業(yè)等。在飼料工業(yè)上，纖維素酶按一定比例添加到動(dòng)物飼料中，可在牲畜食用前對飼料中纖維素先行部分降解，能促進(jìn)牲畜的消化與吸收，同時(shí)增加其體內(nèi)的纖維素酶含量。紡織工業(yè)方面，纖維素酶可降解衣物表面細(xì)小纖維，使其表面光滑。洗滌工業(yè)方面，在洗滌劑中加入高活性纖維素酶，可增加洗滌劑的活性和穩(wěn)定性，提高去污能力[15]。

5 纖維素降解菌的未來趨勢

纖維素作為可再生、儲(chǔ)量大，但利用不充分的潛在資源，必定是未來研究開發(fā)的重點(diǎn)。自然界中存在大量高產(chǎn)纖維素酶微生物，生物降解纖維素又具有環(huán)保、高效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，因此分離篩選野生纖維素酶高產(chǎn)菌，并對其降解機(jī)制研究一定是重中之重。同時(shí)通過分子手段構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶工程菌也會(huì)作為未來研發(fā)的一大趨勢。