唐 森，黃 霞，覃逸明，吳國勇，張 鵬*

(1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西 來賓 546119； 2.廣西科技師范學(xué)院 特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西 來賓 546119； 3.廣西科技師范學(xué)院 科研管理處，廣西 來賓 546119)

五指毛桃，來自?？崎艑僦参锏母稍锔秩~榕的葉形如五根手指，其果實則狀如毛桃，因此被稱為五指毛桃，又因其根部有椰奶的清香，又被稱為五指牛奶、牛奶木、土黃芪等等，是一種藥食同源的藥用植物。是嶺南地區(qū)習用中草藥[1]。中醫(yī)認為，五指毛桃性平、味甘、辛，對脾虛浮腫、肺癆咳嗽、食少無力、風濕痹痛、盜汗、產(chǎn)后無乳等癥有很好的療效，應(yīng)用歷史悠久，在廣東、廣西、香港等地民間常用其作為煲湯的食材，其保健作用廣為認可[2]。研究表明，五指毛桃還具有止咳、平喘、祛痰、益氣健脾、改善消化、保肝、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、補血、抗突變等生物活性[3-4]。多糖是一種天然高分子化合物，具有廣泛的生物活性，在華夏很多中藥材都以多糖作為主要成分之一，近年來引起各界的關(guān)注。

目前常用的植物多糖提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助溶劑提取法、微波輔助溶劑提取法、超聲-微波協(xié)同提取法、酶解法、超臨界流體萃取法等[5-6]。水熱提取法是目前最常用的植物多糖提取方法，它具有操作簡單、設(shè)備要求低、提取產(chǎn)物綠色無污染等優(yōu)點。響應(yīng)面試驗設(shè)計通過相關(guān)實驗采集數(shù)據(jù)，采取多元二次回歸方程進行擬合自變量和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，對二次多項式回歸方程的計算分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，其預(yù)測結(jié)果可信度高，能夠快速確定多因素系統(tǒng)的最佳實驗條件[7]。本試驗以五指毛桃作為原料，蒸餾水作為提取劑，采用水浴提取法對五指毛桃水溶性多糖進行提取，并在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面法優(yōu)化，確定水浴提取法提取五指毛桃水溶性多糖的最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五指毛桃購于亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，經(jīng)廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室張鵬博士鑒定為五指毛桃，試驗所用葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水多用真空泵(SHZ-D(III)型 鞏義市科瑞儀器有限責任公司)；恒溫水浴鍋(HH-S4型 金壇市醫(yī)療儀器廠)； 數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300DB型 昆山市超聲儀器有限公司)； 紫外/可見分光光度計(UV-9600型 北京北分瑞利分析儀器(集團)公司)；臺式高速冷凍離心機(H3-20KR型 湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；電子分析天平(FA-2004B 型 上海越平科學(xué)儀器有限公司)； 玻璃儀器氣流烘干器(C-20型 上海貝侖儀器設(shè)備有限公司)； 中草藥粉碎機(FW-135型 天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 五指毛桃多糖的提取

將塊狀的五指毛桃用高速萬能粉碎機粉碎，80目過篩后在干燥箱內(nèi)烘干至恒重，備用。精確稱取預(yù)處理后五指毛桃固體粉末2.00 g于錐形瓶中，按照試驗所需的液料比、提取時間、提取溫度進行提取試驗，所得提取提取液經(jīng)真空抽濾、稀釋、離心，所得溶液即為五指毛桃粗多糖溶液。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制[8]

采用苯酚-硫酸法顯色，用紫外分光光度計測定吸光度，回歸方程為：A = 0.0832C-0.1704，R2= 0.9994，線性范圍為3.75～11.25 μg·mL-1。

1.3.3 五指毛桃多糖提取率的測定[9]

吸取2 mL五指毛桃粗多糖提取液于容量瓶中，加入適量蒸餾水進行稀釋，精密吸取2 mL五指毛桃粗多糖稀釋液于具塞試管中，加入Savage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)，混勻，2000 r·min-1離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)至刻度試管中，得到供試品溶液。按照葡萄糖標準曲線方法測定吸光度，由回歸方程計算五指毛桃粗多糖溶液中多糖的濃度，按下式計算五指毛桃粗多糖溶液中多糖的含量：

式中：C為粗提物樣液葡萄糖質(zhì)量濃度(μg·mL-1)，D為稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量(μg)。V為最初樣品定容體積，mL。

1.4 單因素試驗設(shè)計

探究提取時間、提取溫度、液料比對五指毛桃中水溶性多糖提取率的影響。固定液料比60∶1 mL/g，提取溫度80℃，設(shè)定提取時間30、60、90、120、150 min；固定液料比60∶1 mL/g，提取時間60 min，設(shè)定提取溫度50、60、70、80、90℃；固定提取溫度80℃，提取時間60 min，設(shè)定液料比40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、100∶1 mL/g。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在最佳單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇主要的3個因素：提取時間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)為自變量，以水溶性多糖提取率為主要目標，利用Design-Expert 8.0.6的中心組合實驗設(shè)計原理進行3因素3水平的實驗設(shè)計，并確定水浴提取方法的最佳工藝條件，如表1所示為響應(yīng)面設(shè)計測試因子的水平和編碼表。

表1 響應(yīng)面因素與水平

1.6 驗證工藝

選取響應(yīng)面試驗得出的最優(yōu)提取工藝，平行3組，計算多糖提取率，以確定五指毛桃多糖的最優(yōu)提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時間單因素試驗結(jié)果

固定液料比60 mL/g，提取溫度80℃，考察提取時間為30，60，90，120 min時的多糖提取率。如圖1所示，提取時間60 min時，多糖提取率達到最大值，1.12%。當時間繼續(xù)延長時，多糖提取率呈下降趨勢。因此最佳提取時間為60 min。

圖1 提取時間對多糖提取率影響

2.2 提取溫度單因素試驗結(jié)果

固定料液比60 mL/g，提取時間60 min，考察提取溫度為50，60，70，80，90℃時的多糖提取率。如圖2所示，提取溫度80℃時，多糖提取率達到最大值，1.35%。溫度升高說明分子之間的運動更劇烈，反應(yīng)的效率更快，在較高的溫度里，多糖的溶解度也會增大，當繼續(xù)提高溫度時，多糖提取率就會呈現(xiàn)下降趨勢，說明溫度過高，導(dǎo)致提取率下降，所以選取80℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對多糖提取率影響

2.3 液料比單因素試驗結(jié)果

固定提取溫度80℃，提取時間60 min，考察液料比為40∶1，50∶1，60∶1，80∶1和100∶1 mL/g時的多糖提取率。如圖3所示，液料比60∶1 mL/g時多糖提取率達到最大值1.18%。當水量繼續(xù)增加時多糖提取率反而呈下落的趨勢，可能是由于溶劑量太大，影響了對五指毛桃多糖的溶出度，從而影響了多糖的提取率。因此提取最佳液料比為60∶1 mL/g。

圖3 液料比對多糖提取率影響

2.4 響應(yīng)面試驗

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計三因素試驗考察，本次實驗共有分為兩種類型的17個試驗點，第一類為析因點，是自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點，析因點共有12個。第二類為位于區(qū)域中心的各自變量均為零水平的重復(fù)試驗點，用來檢驗回歸方程與中心試驗點的擬合情況，同時可以提供剩余自由度，以提高試驗的精度，本次試驗設(shè)計的零點實驗重復(fù)5次。對計算出的試驗條件按步驟 1.3 進行多糖提取試驗，求得相應(yīng)條件下的多糖提取率，以 Design expert 8.0.6.1 版軟件對所得試驗結(jié)果進行分析，所得結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗條件及結(jié)果

在試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上以 A(提取時間)、B(提取溫度)、C(液料比)為自變量，Y(提取率)為響應(yīng)值，求得多糖提取率對三因子的擬合回歸方程為Y=1.29+0.075A+0.00375B-0.041C+0.063AB+0.013AC-0.010BC-0.066A2-0.19B2-0.12C2。

表3 響應(yīng)面分析結(jié)果

注：*p<0.05 表示差異顯著，**p<0.01 表示差異極顯著。

模型的方差分析由軟件Design-Expert 8.0.6完成，結(jié)果如表3所示，分析表格中的數(shù)據(jù)，通過P值來判斷[17]，發(fā)現(xiàn)擬合出的方程中各個因子對響應(yīng)值的影響是顯著性的。由表3能夠得出，回歸模型極顯著(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.242>0.05)，R2=0.9948，結(jié)果表明，此模型具有良好的擬合程度，每一個單因素變量與響應(yīng)值之間都存在著顯著的線性關(guān)系，可以用來預(yù)測和分析出響應(yīng)面值，分析多糖的提取率?；貧w方程的各項方差分析表明，A、AB對五指毛桃水溶性多糖有極顯著的影響(P<0.01)，二次項A2、B2、C2對提取率的影響極顯著(P<0.01),說明五指毛桃多糖與各個因子之間不僅僅是簡單的線性關(guān)系。因子C的作用顯著(P<0.05)，因子B、AC、BC對五指毛桃水溶性多糖提取率無顯著影響(P>0.05)。

2.4.2 等高線圖及響應(yīng)面圖分析

由圖 4相關(guān)因素的3D響應(yīng)面圖及等高線圖結(jié)合可看出，隨著提取時間的延長，五指毛桃多糖提取率逐漸增大，當溫度低于80℃時，多糖提取率隨著溫度的升高而增大，這是因為溫度升高，分子運動速度加快，滲透、溶解、擴散速度加快，溶液對多糖的溶解度增大。然而當溫度溫度高于80℃后，由于高溫使熱穩(wěn)定性差的多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生降解從而造成多糖提取率降低。以上這三個因素對多糖的提取率都有一定的影響，其中影響最為顯著的是提取的時間，其次到液料比，受影響最小的是提取的溫度，在等高線圖中，提取溫度跟提取時間橢圓形狀最為明顯，這就說明提取溫度跟提取時間之間的相互作用對多糖提取率的影響較大，提取時間跟提取液料比之間的相互作用次之，而提取溫度跟時間之間的交互作用幾乎為圓形，說明這兩個因素之間的相互作用對多糖的提取率影響不大。

圖4 液料比、提取時間、提取溫度對五指毛桃多糖提取率影響的響應(yīng)面與等高線

Fig.4 Response surface and contour line of the effect of liquid-material ratio,extraction time and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharide from five-fingered mulberry peach

2.4.3 響應(yīng)面模型驗證

根據(jù)軟件Design-Expert 8.0.6預(yù)測的五指毛桃多糖提取最佳工藝為：提取時間83.14 min，提取溫度82.03℃，液料比54.16∶1 mL/g。在該條件下五指毛桃多糖提取率的理論值可達1.31244 %?？紤]到試驗的實際操作性，將提取條件修正為時間83 min，溫度82℃，液料比54∶1 mL/g。試驗重復(fù) 3 次，所得五指毛桃多糖實際提取率為1.312%±0.005%，該結(jié)果與理論值較為吻合。

3 結(jié)論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化五指毛桃水溶性多糖的提取工藝。試驗結(jié)果表明，建立的二元多項式回歸方程的擬合度較好，由其預(yù)測并根據(jù)實際情況修正得到五指毛桃水溶性多糖最佳的提取工藝條件為：提取時間83 min，提取溫度82℃，液料比54∶1 mL/g。在此條件五指毛桃水溶性多糖的提取率為1.312%±0.005%。由此可見，采用水浴

提取法提取，結(jié)合響應(yīng)面試驗優(yōu)化參數(shù)，是水溶性多糖提取的一種可靠有效的方法?？梢姡\用響應(yīng)面法優(yōu)化五指毛桃多糖提取工藝參數(shù)切實可靠，為后續(xù)進一步研究提供相應(yīng)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期開發(fā)為藥物或保健食品。