張 燕 魏汝君 馬中蘇 劉 珍 張 婷 劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長春130062）

在需氧生物機(jī)體內(nèi)，正常的氧化代謝活動(dòng)都會產(chǎn)生自由基，而機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等）以及抗氧劑（VE、VC、肌肽、谷胱甘肽等）能有效消除并使其維持在適宜的濃度[1-2]。適宜濃度的自由基執(zhí)行著重要的生物學(xué)功能，并對機(jī)體產(chǎn)生有益的作用。然而，當(dāng)機(jī)體隨著年齡的增長或者長期處于某種不良環(huán)境中時(shí)，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除機(jī)制就會失衡，即產(chǎn)生氧化應(yīng)激。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，過量積累的自由基會對細(xì)胞成分及一些生物大分子進(jìn)行攻擊，如對DNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸、脂類和質(zhì)膜進(jìn)行攻擊和破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織的氧化性損傷[3-4]。研究表明，自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)（oxidative stress，OS）與心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病及衰老等密切相關(guān)[5-9]。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是體內(nèi)具有重要生理功能的活性三肽，由谷氨酸（glutamate，Glu）、半胱氨酸（cysteine，Cys）和甘氨酸（glycine，Gly）組成，為細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化分子，可以清除細(xì)胞內(nèi)自由基和過氧化氫，對維持細(xì)胞完整和抗氧化應(yīng)激損傷起非常重要的作用。體內(nèi)GSH主要由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthethase，γ-GCS）和GSH合成酶催化合成，其中γ-GCS是最重要的調(diào)節(jié)和限速酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GSH水平[10]。當(dāng)細(xì)胞暴露于高濃度過氧化氫時(shí)，GSH在谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的作用下，把H2O2還原為H2O，而GSH本身被氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）[11]，GSH作為還原過程的底物而被大量消耗，GSH還會與活性氧等結(jié)合[12]，因此細(xì)胞中GSH含量下降。有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度H2O2可抑制抗氧化的γ-GCS表達(dá)[13]，細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下γ-GCS含量也會下降。本文通過建立過氧化氫誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化損傷模型，應(yīng)用Elisa法和RT-PCR法檢測蛋清源活性肽對HEK293細(xì)胞GSH和γ-GCS表達(dá)的變化，探討H2O2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化損傷與γ-GCS基因表達(dá)水平之間的關(guān)系，為揭示氧化應(yīng)激抑制作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清源肽（＞95%），上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；熒光素鈉（Fluorescein sodium）、Trolox（6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸）、AAPH（偶氮二異丁脒鹽酸鹽）（分析純），美國Sigma公司；人胚腎細(xì)胞（HEK293），中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基，美國GIBCO公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜、EDTA，北京鼎國生物有限公司；過氧化氫（分析純），天津化學(xué)有限公司；MTS單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒，美國Promega公司；GSH和GSSG檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶（γ-GCS）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；EastepRSuper總RNA提取試劑盒，上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；SYBRRPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）實(shí)時(shí)熒光定量PCR專用試劑，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，日本尼康；CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad；黑色孔板（透明平底），德國Greiner Bio-One公司；移液器，德國Eppendorf公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清活性肽氧自由基吸收能力（ORAC）測定 ORAC試驗(yàn)參考實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[13-14]并略作修改。反應(yīng)在75mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）溶液中進(jìn)行。將試驗(yàn)分為對照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組：吸取20μL樣品溶液/Trolox和120 μL熒光素鈉溶液（終濃度為70 nmol/L）至黑色96孔板各孔中混合反應(yīng)，對照組使用20μL PBS替代樣品溶液，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在37℃下預(yù)熱2min，然后用多道移液器快速加入60μL AAPH溶液（終濃度為12mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，隨即將黑色96孔板放入酶標(biāo)儀中，在37℃下檢測記錄。相鄰兩個(gè)測定點(diǎn)之間的時(shí)間間隔為2min，每次讀數(shù)前振板2 s，連續(xù)測定180min（熒光衰減趨于穩(wěn)定為止）。設(shè)置酶標(biāo)儀的激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為520 nm。AAPH自由基作用下的熒光衰退曲線下面積計(jì)算公式為：

式中：f0——初始0 min時(shí)的熒光相對強(qiáng)度；fi——第i個(gè)測定點(diǎn)時(shí)的相對熒光強(qiáng)度。

樣品的保護(hù)面積Net AUC計(jì)算公式為：

Trolox是維生素E的水溶性類似物，是一種常用的抗氧化劑和自由基清除劑。在ORAC法中Trolox溶液可作為陽性對照物和標(biāo)準(zhǔn)溶液。

ORAC值以Trolox值（Trolox equivalent，TE）來表示，單位為μmol/L TE/μmol/L，其計(jì)算公式為：

1.3.2 蛋清源活性肽對過氧化氫誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞GSH、GSSG及GSH/GSSG的影響 將HEK293細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為5.0×105細(xì)胞/mL，每孔接種量1.5mL（每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，保護(hù)組加入250μL蛋清源活性肽WNWAD（終濃度為0.5，1，5μmol/L和10μmol/L）、WNW（終濃度為1，5 μmol/L和10μmol/L）、WAD（終濃度為1，5μmol/L和10mol/L）、WN（終濃度為1，5μmol/L和10 μmol/L），空白組和損傷組加入250μL培養(yǎng)基。5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后損傷組和保護(hù)組同時(shí)加入250μL終濃度為400μmol/L的H2O2溶液，空白組加入250μL培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育12 h后按照碧云天GSH和GSSG檢測試劑盒（s0053）說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.3.1 設(shè)計(jì)引物 引物由上海捷瑞生物有限公司設(shè)計(jì)并合成，γ-GCS和DAPDH引物序列見表1。

表1 引物序列圖Table1 The sequence of the primer pairs

1.3.3.2 提取RNA 將密度為6.0×104細(xì)胞/mL的HEK293細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種終體積為2mL。設(shè)置對照組（1.5mL細(xì)胞混懸液+250 μL培養(yǎng)基）、損傷組（1.5mL細(xì)胞混懸液）和保護(hù)組（1.5mL細(xì)胞混懸液），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，保護(hù)組加入250μL不同終濃度的蛋清肽，其中，WNWAD（終濃度為0.1，0.3，0.5，1，5μmol/L和10μmol/L）、WNW（終 濃度1，5μmol/L和10μmol/L）、WAD（終濃度為1，5μmol/L和10μmol/L）、WN（終濃度為1、5和10μmol/L），同時(shí)損傷組加入250μL培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。然后，損傷組和保護(hù)組同時(shí)加入終濃度為400μmol/L的H2O2溶液250μL，對照組加入培養(yǎng)基250μL，繼續(xù)孵育6 h后提取RNA。利用EastepRSuper總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，通過電泳查看RNA的完整性。

1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄 SYBR Green qPCR法最多可使用1μg的Total RNA，用DEPC處理水將RNA含量調(diào)整到1μg，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書去除基因組DNA，最后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中反應(yīng)37℃15min，85℃5 s后取出cDNA，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量 各cDNA樣品分別以GAPDH和γ-GCS為引物，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，包含：SYBRRGreen I預(yù)混液（12.5μL）、GAPDH和γ-GCS正、反向引物各1μL、反轉(zhuǎn)錄制得的cDNA溶液4μL以及滅菌蒸餾水（8.5μL）配制混合物，充分混勻后反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃下30 s實(shí)現(xiàn)預(yù)變性，95℃下變性5 s、60℃下退火30 s，95℃下延伸15 s、60℃下退火30 s 40次循環(huán)。在調(diào)整基線周期和計(jì)算閾值，得出循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）。最終結(jié)果以相對指數(shù)法（2-ΔΔCt）表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD，n=3）來表示。使用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS19.0版處理，差異顯著性通過單因素方差分析（ANOVA）來分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清源活性肽的氧自由基吸收能力（ORAC活性）

氧自由基吸收能力（ORAC法）是普遍被接受的抗氧化能力評價(jià)方法，可以直接反映抗氧化劑阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的能力，是最接近人體生理系統(tǒng)真實(shí)反應(yīng)情況的實(shí)驗(yàn)方法，同時(shí)也是對食品強(qiáng)化劑和其它植物性治療藥物進(jìn)行質(zhì)量控制和檢測其抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法。ORAC反應(yīng)是典型的基于氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制（HAT）的氧化過程，氫原子轉(zhuǎn)移是自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的關(guān)鍵步驟，反應(yīng)后會形成更加穩(wěn)定的自由基[16]。

蛋清源活性肽在終濃度為5μmol/L時(shí)的熒光衰退曲線如圖1所示。WNWAD及其結(jié)構(gòu)改造肽（除AD肽）對AAPH引起的時(shí)間依賴型熒光衰減有顯著影響，可明顯減緩熒光衰減速度。對照組（PBS代替抗氧化劑）和試驗(yàn)組AD肽，熒光衰減速度最快，反應(yīng)開始30min后，熒光衰減曲線趨于穩(wěn)定，相對熒光強(qiáng)度接近0，而Trolox組和試驗(yàn)組WNWAD、WNW、WAD和WN熒光衰減較對照組均放緩，說明蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD、WN都有一定的抗氧化活性。其中，五肽WNWAD的抗氧化能力最強(qiáng)，180min后，相對熒光強(qiáng)度接近0；WNW和WAD抗氧化能力次之，150min后，相對熒光強(qiáng)度趨于0；WN 110min后，相對熒光強(qiáng)度趨于0；而Trolox 55min左右相對熒光強(qiáng)度趨于0。在濃度為5μmol/L時(shí)，WNWAD的氧自由基吸收能力約為Trolox的5.69倍。WN、WAD、WNW的氧自由基吸收能力分別為Trolox的4.04，3.96，2.66倍。除肽AD外，其余4個(gè)蛋清肽WNWAD、WNW、WAD和WN的抗氧化能力均強(qiáng)于Trolox。

Hernandez-Ledesma等[1]測定了不同氨基酸的ORAC活性，結(jié)果色氨酸（Trp）殘基的ORAC活性最強(qiáng)（ORAC值為4.649μmol/L TE），色氨酸（Trp）的強(qiáng)抗氧化活性可能與其吲哚基團(tuán)的供氫能力有關(guān)。ORAC試驗(yàn)中偶氮類自由基（AAPH）熱分解后可轉(zhuǎn)化為過氧化自由基，與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)。分析上述肽的氨基酸組成，可以發(fā)現(xiàn)具有抗氧化性的肽鏈（WNWAD、WNW、WAD、WN）中均含有色氨酸殘基，色氨酸是芳香族氨基酸，其結(jié)構(gòu)特殊，在反應(yīng)中易失去氫原子而與自由基發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)色氨酸存在于肽氨基酸序列中時(shí)，肽表現(xiàn)出一定的供氫能力；而肽AD序列中不存在色氨酸殘基，沒有抗氧化能力。

2.2 蛋清源活性肽對過氧化氫誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞GSH、GSSG及GSH/GSSG的影響

有研究表明，GSH能夠改善細(xì)胞的還原狀態(tài)，提高細(xì)胞的抗氧化能力[18]。GSSG在細(xì)胞中過量積累，使細(xì)胞氧化還原動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，給生物體帶來不良影響[19-20]。由圖2及圖3可以看出，過氧化氫誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化損傷模型組細(xì)胞中GSH含量由（173.52±2.87）μmol/L降至（115.85±2.03）μmol/L（P＜0.01），而GSSG含量顯著升高，由對照組（0.90±0.08）μmol/L升至（33.23±0.68）μmol/L（P＜0.01）?？梢?，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，GSH作為細(xì)胞內(nèi)天然抗氧化劑，在受到氧化損傷作用后大量轉(zhuǎn)化成GSSG，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSSG含量迅速增加。用蛋清源活性肽處理的保護(hù)組細(xì)胞中，GSSG含量與損傷組相比明顯降低，在0.5μmol/L WNWAD作用下由（33.23±0.68）μmol/L降至（0.96±0.02）μmol/L（P＜0.01），GSH含量與損傷組相比有不同程度的升高，說明蛋清源活性肽能夠有效消除H2O2刺激機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基，減少GSH轉(zhuǎn)化成GSSG，從而降低GSSG含量，保持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡。

圖1 蛋清源活性肽氧自由基吸收能力（ORAC法）Fig.1 Peroxyl radical scavenging activity（ORAC assay）of peptides from egg white

表2 蛋清源活性肽保護(hù)面積NetAUCTable2 The NetAUC of the peptides from egg white

表3 蛋清源活性肽的氧自由基吸收能力（TEAC值）Table3 Oxygen radical absorbtion activity of peptides from egg white

在生物體內(nèi)，GSH/GSSG比值約為100∶1時(shí)，機(jī)體處于穩(wěn)恒性動(dòng)態(tài)平衡[21]。穩(wěn)定的GSH/GSSG的正常比值是維持細(xì)胞正常生理過程的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，而且是細(xì)胞重要的抗氧化系統(tǒng)之一[27]。如圖4所示，對照組細(xì)胞沒有外界因素影響，處于平衡狀態(tài)，其GSH/GSSG比值為192.69±0.08，說明細(xì)胞和整個(gè)機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)時(shí)的GSH/GSSG比值存在一定偏差。在H2O2處理過的損傷組細(xì)胞中，GSH/GSSG比值與對照組相比急劇降低（P＜0.01），僅為3.49±0.68；而不同濃度蛋清源活性肽處理細(xì)胞后，GSH/GSSG比值不同程度升高。濃度均為1μmol/L的WNWAD、WNW、WAD和WN處理過的細(xì)胞GSH/GSSG比值分別為113.22±0.12，57.08±0.09，61.94±0.19，31.35±0.35，與損傷組比差異顯著（P＜0.01）?？梢?，蛋清源活性肽能夠降低氧化應(yīng)激損傷帶來的危害，在一定程度上維持了GSH/GSSG比值的穩(wěn)定。圖3 蛋清源活性肽對HEK293細(xì)胞內(nèi)GSSG含量的影響

圖2 蛋清源活性肽對HEK293細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響Fig.2 The effect of peptides on the content of GSH in HEK293 cells

圖3 蛋清源活性肽對HEK293 細(xì)胞內(nèi)GSSG 含量的影響Fig.3 The effect of peptides on the content of GSSG in HEK293 cells

圖4 蛋清源活性肽對HEK293細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值的影響Fig.4 The effect of peptides on GSH/GSSG ratio in HEK293 cells

2.3 蛋清源活性肽對過氧化氫誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞γ-GCS mRNA表達(dá)的影響

用real-time PCR方法對HEK293細(xì)胞γ-GCS基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，試驗(yàn)中γ-GCS和內(nèi)參GAPDH基因溶解曲線均呈單峰（圖5左邊單峰較低的曲線代表γ-GCS基因溶解曲線，右邊單峰較高的曲線代表GAPDH基因），說明這2個(gè)基因引物特性較好，基因擴(kuò)增曲線穩(wěn)定，可用于進(jìn)一步分析。

研究表明，γ-GCS含量和活性增加，能促進(jìn)GSH合成速度，且γ-GCS表達(dá)水平會直接影響細(xì)胞中GSH含量[22-25]。在高水平的氧化應(yīng)激作用下，γ-GCS抗氧化應(yīng)激能力可能受到損害，使得γ-GCS表達(dá)降低而失去保護(hù)細(xì)胞的能力[24]。如圖6所示，損傷組的細(xì)胞中，γ-GCS mRNA相對表達(dá)量為0.185，即表達(dá)量降為對照組的18.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），γ-GCS基因表達(dá)受到明顯的抑制。其中的氧化應(yīng)激機(jī)理可能是γ-GCS基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致GSH合成減少，同時(shí)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧引起GSH消耗增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH含量減少，GSH/GSSG穩(wěn)態(tài)失衡。有大量研究γ-GCS與抗氧化有很大關(guān)系。劉立新等[26]研究表明參苦補(bǔ)肺方可以激活KLF2、Nrf-2、γ-GCS的活性，誘導(dǎo)GSH的大量生成來清除肺內(nèi)過多的氧化物質(zhì)。曹義甫等[27]研究了丁苯酞通過激活Nrf-2通路，上調(diào)γ-GCS的表達(dá)，進(jìn)而“中和”ROS，緩解氧化應(yīng)激對腎間質(zhì)的損傷，延緩腎間質(zhì)纖維化。尚立群等[28]研究表明安石榴苷可顯著促進(jìn)Nrf2/γ－GCS信號通路的活化，提高慢性支氣管炎大鼠的抗氧化能力。本試驗(yàn)中不同濃度的蛋清源活性肽處理HEK293細(xì)胞后，γ-GCS mRNA相對表達(dá)量較損傷組都有一定程度的提高，濃度1，5，10μmol/L的WN對γ-GCS mRNA相對表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。濃度5μmol/L的WN作用后，細(xì)胞中γ-GCS mRNA相對表達(dá)量最高，相對表達(dá)量為8.53。有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2能夠在細(xì)胞核中與氧化應(yīng)答元件結(jié)合，增強(qiáng)過氧化氫酶、γ-GCS等抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化性[29-33]?；羰讼嫉萚34]研究發(fā)現(xiàn)高良姜素能夠增加γ-GCS表達(dá)量，從而激活Nrf2信號通路使相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)量增加而起到抗氧化作用。蛋清源活性肽氧化應(yīng)激抑制機(jī)理是否與Nrf-2通路有關(guān)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、管家基因GAPDH溶解曲線Fig.5 Melt Peak ofγ-GCS and GAPDH

圖6 蛋清源活性肽對HEK293細(xì)胞γ-GCS m RNA表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of peptides on the expression ofγ-GCS mRNA in HEK293

3 結(jié)論

氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。當(dāng)機(jī)體暴露于ROS時(shí)，其自身能誘導(dǎo)出一系列保護(hù)性蛋白，以緩解細(xì)胞所受的損害[26]。在對蛋清源肽WNWAD，WNW，WAD，WN，AD的研究中發(fā)現(xiàn)，除了肽AD外，其余4條肽不僅有體外氧自由基吸收能力，而且能有效緩解細(xì)胞中GSH含量的降低，并維持GSH/GSSG比值在細(xì)胞中的穩(wěn)定平衡狀態(tài)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，GSH含量降低，蛋清源活性肽會消除活性氧而減少GSH的消耗。γ-GCS是體內(nèi)還原型谷胱甘肽合成的限速酶，蛋清源活性肽通過上調(diào)γ-GCS的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。