曹偉偉 吳 婷 方雅靜 程玉鑫 潘思軼 徐曉云

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 武漢430070）

黃嘌呤氧化酶（XOD）是嘌呤代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，主要催化次黃嘌呤和黃嘌呤為尿酸。過(guò)高的XOD活性會(huì)導(dǎo)致尿酸的生成過(guò)多，進(jìn)而誘發(fā)高尿酸血癥、痛風(fēng)等多種常見(jiàn)代謝性疾病[1]。當(dāng)尿酸在機(jī)體的水平超過(guò)其飽和濃度時(shí)，導(dǎo)致其以尿酸鈉（MSU）晶體形式沉積于組織中，進(jìn)而引起促炎因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的分泌等痛風(fēng)炎癥反應(yīng)[2]。常見(jiàn)的XOD抑制劑別嘌醇和緩解痛風(fēng)炎癥藥物秋水仙堿是臨床上常用的降尿酸和抗痛風(fēng)炎癥的藥物，然而，這些藥物具有胃腸不適、肝腎損傷等副作用[3-4]。而天然植物化合物由于在抑制XOD活性和MSU介導(dǎo)的炎癥方面具有雙重效果、副作用小等優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多的關(guān)注[5-6]。篩選并評(píng)價(jià)天然膳食化合物對(duì)于XOD和痛風(fēng)炎癥的抑制具有重要意義。

藜蒿（Artemisia selengensis Turcz）屬于菊科蒿屬植物，是一種主要種植在我國(guó)南方區(qū)域的蔬菜，嫩莖常供食用。藜蒿富含多酚和三萜等活性成分，古籍中報(bào)道其可用于治療發(fā)熱、風(fēng)濕病和肝炎等多種疾病[7]。近年的研究表明，藜蒿具有抑制XOD[8]、炎癥因子白細(xì)胞介素6（IL-6）分泌[9]等多種藥理活性。雙咖啡?？鼘幩幔╠i-CQA）是一類常見(jiàn)的存在于咖啡、茶葉、蔬菜等植物中的多酚類化合物[10-12]，由于咖啡酸的取代位置不同，共有6種同分異構(gòu)體[13]（結(jié)構(gòu)如圖1所示）。目前，已有關(guān)于藜蒿葉中的1，3-diCQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA抑制XOD的活性報(bào)道[14]，然而藜蒿葉中是否存在其它結(jié)構(gòu)的di-CQA，以及不同的di-CQA化合物抑制XOD活性的結(jié)構(gòu)特征尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。

本研究首次從藜蒿葉中鑒定出1，4-diCQA，與其它di-CQA相比，1，4-diCQA在植物中分布較少，僅在朝鮮薊（Cynara scolymus L.）[15]、蓖齒蒿（Artemisia pectinate）[16]等少數(shù)植物中有報(bào)道。目前1，4-diCQA僅有抑制黑色素生成的報(bào)道[17]，而其它的活性研究鮮有報(bào)道。

研究表明di-CQA化合物具有抗炎活性。從藜蒿葉中分離的1，3-diCQA可抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）刺激的MG-63細(xì)胞分泌IL-6[9]。富含3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA的苦丁茶提取物可抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[18-19]。現(xiàn)有關(guān)于di-CQA的抗炎研究中，炎性的誘導(dǎo)方式、引發(fā)的炎癥反應(yīng)與MSU引起的炎癥因子IL-1β并不相同。痛風(fēng)炎癥因子IL-1β的分泌由兩條信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)：首先，脂多糖（LPS）或者其它NF-κB激活劑作為第1刺激信號(hào)激活NF-κB通路；其次，MSU作為第2刺激信號(hào)激活NLRP3炎癥小體，將pro-IL-1β前體蛋白切割成分泌的IL-1β[20]。目前di-CQA單體能否抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β分泌尚不清楚，其相關(guān)抑制作用的構(gòu)效關(guān)系研究亦未見(jiàn)報(bào)道，這限制了膳食中di-CQA在降尿酸和抗痛風(fēng)炎癥方面的應(yīng)用。

本文采用HPLC-Q/TOF-MS對(duì)藜蒿葉提取物中的di-CQA進(jìn)行定性、定量分析，同時(shí)，研究了di-CQA抑制XOD和抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β的結(jié)構(gòu)特征。本研究為藜蒿及其它膳食中分布廣泛的di-CQA應(yīng)用于預(yù)防高尿酸血癥和痛風(fēng)提供了借鑒。

圖1 不同di-CQA的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of different di-CQAs

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

藜蒿葉由武漢荷香源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。藜蒿葉經(jīng)50℃烘箱干燥12 h后，用粉碎機(jī)粉碎，所得粉末樣品于-20℃下保存。

XOD、黃嘌呤、LPS和佛波酯（PMA），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；別嘌醇（純度＞98%），上海源葉生物科技有限公司。乙腈和甲酸（色譜級(jí)），Thermo Fisher公司。3，4-diCQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA和1，5-diCQA標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%），上海源葉生物科技有限公司。IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，欣博盛生物科技有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

HPLC-Q/TOF-MS，美國(guó)Agilent公司；MULTISKAN GO多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ-300DA超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藜蒿葉提取物的制備 藜蒿葉用50%乙醇（料液比1∶15）在室溫下超聲提取2次，然后真空濃縮，將濃縮提取物依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取分離，棄石油醚相，保留乙酸乙酯相，將其在真空條件下蒸發(fā)完全，然后冷凍干燥即得藜蒿葉提取物。

1.3.2 藜蒿葉提取物di-CQA的定性、定量分析 采用HPLC-Q/TOF-MS對(duì)藜蒿葉提取物中的di-CQA進(jìn)行定性、定量分析。色譜柱：安捷倫Zorbax SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：25°C，流速：1mL/min。流動(dòng)相：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸/水A和乙腈B。洗脫方法：0～10min，10%B；10～15min，15%B；15～17min，18%B；17～37min，18%B；37～42 min，50%B；42～48 min，65%B；48～52 min，80%B；52～58min，80%B；58～62min，10%B，檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm，進(jìn)樣體積：8μL。根據(jù)1，5-diCQA標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=107x-91633，R2=0.9997），藜蒿葉提取物中各di-CQA的含量均用1，5-diCQA物質(zhì)的量表示。

負(fù)離子模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參數(shù)如下：質(zhì)荷比m/z：100～1 100；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；霧化器壓力：3.4×105Pa；干燥氣流：10.0 L/min；去溶劑溫度：325℃；碎裂電壓：175V；碰撞能量：10～40 V。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和加藥處理 THP-1細(xì)胞（購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)）生長(zhǎng)所需的完全培養(yǎng)基為含10%FBS、1%雙抗和50μmol/Lβ-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞在37°C，5%CO2條件下培養(yǎng)。藥物處理組：藥物處理前，先用100ng/mL的PMA處理12 h誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，去除非貼壁細(xì)胞，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用不同的di-CQA單體（100μmol/L）預(yù)處理12 h，然后用LPS（1μg/mL）孵育細(xì)胞2 h，MSU（200μg/mL）繼續(xù)刺激4 h。對(duì)照組THP-1巨噬細(xì)胞不做藥物處理，模型組僅用MSU刺激LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細(xì)胞，不加di-CQA預(yù)處理。

1.3.4 細(xì)胞存活率的測(cè)定 參考李慧等[21]的方法，測(cè)定不同di-CQA對(duì)MSU刺激的LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細(xì)胞存活率的影響。按照1.3.3節(jié)所述步驟刺激后，將MTT（0.5mg/mL）加入細(xì)胞培養(yǎng)2 h，最后加入150μL二甲基亞砜溶解細(xì)胞中的甲臜，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。

1.3.5 IL-1β的測(cè)定 細(xì)胞加藥處理結(jié)束后，收集細(xì)胞上清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)上清液中IL-1β的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用SPSS 16.0軟件的單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果和討論

2.1 藜蒿葉提取物di-CQA的定性、定量分析

通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片信息比對(duì)的方法鑒定藜蒿葉中的di-CQA。由圖2和表1可知，藜蒿葉提取物中（峰2～5）4個(gè)峰的保留時(shí)間、最大紫外吸收波長(zhǎng)、母離子[M-H]-、碎片離子及其相對(duì)豐度與3，4-diCQA、1，5-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA這4種di-CQA標(biāo)準(zhǔn)品一致，也與Zhang等[22]報(bào)道的藜蒿葉中的di-CQA質(zhì)譜信息一致，因此，藜蒿葉提取物中的這4種化合物（峰2～5）分別為3，4-diCQA、1，5-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA。

藜蒿葉提取物中峰1母離子[M-H]-為515.1224，其碎片離子m/z 203相對(duì)豐度為49%（以m/z 353為基峰），該碎片離子從未在以前關(guān)于藜蒿葉di-CQA結(jié)構(gòu)的鑒定研究中報(bào)道，與Clifford等[13]采用液-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定的1，4-diCQA碎片離子的相對(duì)豐度接近，峰1也與1，4-diCQA標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、最大吸收波長(zhǎng)、母離子和碎片離子信息一致，因此，藜蒿葉提取物中峰1對(duì)應(yīng)的化合物為1，4-diCQA。本研究首次報(bào)道了1，4-diCQA存在于藜蒿葉中。以上研究表明，藜蒿葉含有除1，3-diCQA外所有的di-CQA異構(gòu)體，藜蒿是多種di-CQA的膳食來(lái)源。

通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定了藜蒿葉提取物中di-CQA的含量。由表1可知，藜蒿葉提取物中不同di-CQA含量從高到低排序?yàn)?，5-diCQA（13.06%）＞1，5-diCQA（6.85%）＞4，5-diCQA（4.72%）＞3，4-diCQA（1.39%）＞1，4-diCQA（0.39%）。其中，1，4-diCQA含量顯著低于其余4種di-CQA，這也可能是以前關(guān)于藜蒿化學(xué)成分的研究未報(bào)道1，4-diCQA存在的原因。

圖2 藜蒿葉提取物和di-CQA標(biāo)品的液相色譜圖（a）及5種di-CQA的二級(jí)質(zhì)譜圖（b-f）Fig.2 HPLC chromatogram of Artemisia selengensis Turcz leaf extract and five di-CQA standards（a），MS2 spectra of five di-CQA standards（b-f）

表1 藜蒿葉提取物中di-CQA的定性、定量分析Table1 Qualitative and quantitative analysis of di-CQAs in Artemisia selengensis Turcz leaf extract

2.2 di-CQA抑制XOD的定性構(gòu)效關(guān)系研究

由表2可知，6種di-CQA抑制XOD的IC50值的大小排序?yàn)椋?，4-diCQA＞別嘌醇＞1，5-diCQA＞1，3-diCQA＞4，5-diCQA＞3，4-diCQA＞3，5-diCQA，其中4，5-diCQA抑制XOD的活性大于3，4-diCQA，該結(jié)果與Chen等[23]的報(bào)道一致。1，4-diCQA抑制XOD的活性顯著高于其余5種di-CQA和陽(yáng)性藥別嘌醇，說(shuō)明C1和C4取代對(duì)于提高di-CQA對(duì)XOD的抑制活性至關(guān)重要。通過(guò)比較相似結(jié)構(gòu)的化合物抑制XOD的活性，可以獲得有利于di-CQA抑制XOD的活性取代位置。如從1，3-diCQA＞3，4-diCQA＞3，5-diCQA抑制XOD的效果可以得到咖啡酸的C1取代＞C4取代＞C5取代；從1，4-diCQA＞1，5-diCQA＞1，3-diCQA抑制XOD的效果中可以得到咖啡酸的C4取代＞C5取代＞C3取代。定性構(gòu)效關(guān)系表明，di-CQA不同咖啡酸取代位置對(duì)其抑制XOD的大小排序?yàn)镃1取代＞C4取代＞C5取代＞C3取代。

表2 不同di-CQA抑制XOD的IC50值Table2 The IC50 of different di-CQAs on XOD inhibition

2.3 di-CQA抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β的定性構(gòu)效關(guān)系研究

IL-1β是痛風(fēng)炎癥發(fā)生過(guò)程中重要的炎癥因子[20]。采用MSU刺激的LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細(xì)胞模型研究了6種di-CQA單體在濃度100 μmol/L時(shí)對(duì)IL-1β分泌的影響。MTT結(jié)果（圖3a）表明，在濃度100μmol/L時(shí)，不同結(jié)構(gòu)的di-CQA處理MSU刺激的LPS預(yù)孵育的THP-1巨噬細(xì)胞的存活率與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，表明不同結(jié)構(gòu)的di-CQA對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。圖3b所示，1，3-diCQA和3，5-diCQA在濃度100μmol/L時(shí)對(duì)MSU誘導(dǎo)的IL-1β分泌無(wú)抑制效果，與其它di-CQA相比，1，4-diCQA和1，5-diCQA在該濃度下抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β分泌能力更強(qiáng)，然而二者的抑制能力無(wú)顯著性差異。4種di-CQA在濃度100μmol/L時(shí)對(duì)MSU誘導(dǎo)的IL-1β分泌的抑制率分別為：1，5-diCQA（52.25%）、1，4-diCQA（46.87%）、4，5-diCQA（36.30%）和3，4-diCQA（18.96%），這表明不同咖啡酸的取代位置會(huì)影響di-CQA對(duì)MSU誘導(dǎo)的IL-1β分泌的抑制作用。

通過(guò)比較MSU誘導(dǎo)IL-1β的抑制率大小，可以獲得有利于di-CQA抑制該活性的取代位置。從1，4-diCQA＞4，5-diCQA＞3，4-diCQA抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β效果可以得到C1取代＞C5取代＞C3取代；從1，4-diCQA=1，5-diCQA抑制IL-1β的效果可以得到C4取代=C5取代；從3，4-diCQA＞3，5-diCQA抑制IL-1β的效果可以得到C4取代＞C5取代。di-CQA的不同咖啡酸取代位置對(duì)其抑制IL-1β的大小排序?yàn)镃1取代＞C5取代＞C3取代，C4取代≥C5取代。

圖3 不同di-CQA對(duì)細(xì)胞存活率（a）及MSU誘導(dǎo)的IL-1β分泌的影響（b）Fig.3 Effects of different di-CQAs on cell viability（a）and MSU-induced IL-1βsecretion（b）

2.4 di-CQA抑制XOD與抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β的相關(guān)性分析

由表3可知，di-CQA抑制XOD的IC50與對(duì)MSU誘導(dǎo)的IL-1β抑制率呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.01），皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.674。這表明di-CQA抑制XOD的能力與其抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β活性正相關(guān)，提示di-CQA可能通過(guò)抑制XOD發(fā)揮抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β的活性。此外，MSU引起的IL-1β分泌與活性氧水平升高、NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)[20]。di-CQA是否也可通過(guò)作用上述信號(hào)通路達(dá)到抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β，需進(jìn)一步深入研究。

表3 di-CQA抑制XOD與IL-1β的相關(guān)性分析Table3 Correlation analysis of the XOD inhibitory activity and IL-1βinhibitory activity of di-CQAs

3 結(jié)論

本研究首次發(fā)現(xiàn)了1，4-diCQA存在于藜蒿葉中。定性構(gòu)效關(guān)系表明，不同咖啡酸取代位置對(duì)di-CQA抑制XOD的影響強(qiáng)弱為C1取代＞C4取代＞C5取代＞C3取代；對(duì)di-CQA抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β的影響強(qiáng)弱為C1取代＞C5取代＞C3取代，C4取代≥C5取代。同時(shí)，di-CQA抑制XOD的活性與抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β活性具有正相關(guān)性。本研究系統(tǒng)闡釋了di-CQA化合物抑制XOD和抑制MSU誘導(dǎo)的IL-1β的結(jié)構(gòu)特征，提示藜蒿作為食品具有降尿酸、抗痛風(fēng)炎癥的潛在應(yīng)用價(jià)值。