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        載紫杉醇重組高密度脂蛋白微球的制備和抗胃癌作用研究

        2020-03-06 07:56:42王青楊覓
        浙江醫(yī)學(xué) 2020年2期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞株微球批號(hào)

        王青 楊覓

        在我國(guó),大多胃癌患者初診即為Ⅳ期,5年生存率低于5%[1]。而現(xiàn)今的胃癌化療面臨諸多難題:首先,現(xiàn)有化學(xué)藥物治療對(duì)腫瘤無靶向性;其次,抗腫瘤療效與藥物劑量相關(guān),全身給藥途徑不能使藥物局部濃度增加,因而效果不盡人意。載藥納米微球可通過在特定的組織細(xì)胞中駐留并緩慢釋放藥物而發(fā)揮靶向治療作用,從而達(dá)到較好的治療效果[2-4]。目前,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)鹽酸阿霉素脂質(zhì)體等多種抗腫瘤納米藥物上市,大量抗腫瘤納米藥物也已處于臨床試驗(yàn)階段[5-6]。重組高密度脂蛋白(rHDL)是一種理想的藥物載體,它與人體內(nèi)源性高密度脂蛋白(HDL)類似,可轉(zhuǎn)運(yùn)疏水性藥物,具有良好的生物相容性和長(zhǎng)循環(huán)特征,其表面的載脂蛋白Apo A-I可特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面的受體SR-B1,通過內(nèi)吞機(jī)制將藥物靶向投遞到特定類型的細(xì)胞[7-9]。研究者們發(fā)現(xiàn)SR-B1廣泛存在于多種惡性腫瘤細(xì)胞表面,包括乳腺癌、肝癌以及卵巢癌等[10-13]。

        紫杉醇(PTX)是目前常用的治療胃癌的化療藥物,但臨床使用時(shí)常伴有嚴(yán)重的毒性反應(yīng),如骨髓抑制、超敏反應(yīng)等[14]。本研究采用一種新型無毒制備工藝進(jìn)行載紫杉醇重組高密度脂蛋白(PTX-rHDL)微球的合成,觀察其理化性質(zhì)及存放穩(wěn)定性,并通過細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察其體內(nèi)外抗腫瘤療效,以期為PTX-rHDL微球的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.2 主要試劑 PTX原藥(批號(hào):WS-20170913,江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司);大豆卵磷脂(批號(hào):160lPC-77,日本 TCI公司);Apo A-Ⅰ(批號(hào):GP20180563,美國(guó)Sigma公司);NBD-PE(批號(hào):171022,美國(guó) Avati Polar Lipids公司);胎牛血清(FBS,批號(hào):160903,蘭州民海生物有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)液(批號(hào):1900-141,美國(guó)Gibco公司);四亞基偶氮唑藍(lán)(MTT)(批號(hào):09052345,美國(guó)Amersco公司);十二烷基硫酸鈉(批號(hào):0B7103256,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);四甲基二乙胺(TEMED)(批號(hào):13M00163,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);過硫酸銨(批號(hào):0AA10211,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris)(批號(hào):DH35-3.1,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);甲叉雙丙烯酰胺(批號(hào):0B410295,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);丙烯酰胺(批號(hào):0BD109101,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);磷脂膜染料(NBD-PE)(批號(hào):60025,美國(guó)Biotium公司);兔抗SR-B1抗體(批號(hào):GR149558-14,美國(guó)NOVUS Biologicals公司);辣根過氧化物酶HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG(批號(hào):4413,美國(guó)Cell Signaling公司);β-actin(批號(hào):4970,美國(guó)Cell Signaling公司);RIPA裂解液(批號(hào):P0013,碧云天生物技術(shù)公司);BCA試劑盒(批號(hào):KGP902,南京凱基公司);截留分子量為8 000-10 000透析袋(批號(hào):201600307,南京大治生物科技有限公司),人胃癌細(xì)胞株MKN-45和SGC-7901(中科院上海細(xì)胞生物研究所);乙腈(批號(hào):PX24235D,德國(guó) Merck公司);鹽酸(批號(hào):201601190,天津市大茂化學(xué)試劑廠)、無水乙醇(批號(hào):201610530,天津市大茂化學(xué)試劑廠),水為去離子水。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 PTX-rHDL微球的制備 取10mg大豆卵磷脂和1mg PTX加入2ml乙醇溶液中,攪拌5min使其完全溶解,30℃恒溫下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào):DZF-6092,上海一恒科學(xué)儀器有限公司)將溶劑吹干,制成均勻的脂質(zhì)薄膜,干燥1h;加入0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)10ml,水浴超聲(型號(hào):KH-500B,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)5h,水溫持續(xù)控制在48℃以下,形成脂質(zhì)懸液;加入0.05mg Apo A-Ⅰ,上述溶液以4℃保存過夜,再將該溶液置入透析袋,放置于以PBS中透析24h制備的微球4℃保存。通過透析法將合成的微球與游離PTX及大豆卵磷脂分離。空白納米粒子的制備除去不加藥物外其余過程同上。

        1.3.2 PTX-rHDL微球表征觀察 (1)穩(wěn)定性:制備的微球以4℃保存,在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)分別取出1ml微球,用動(dòng)態(tài)光散射儀(型號(hào):NanoBrook 90plus,美國(guó)Brookheave公司)測(cè)量粒徑的變化,評(píng)估穩(wěn)定性,所有結(jié)果均測(cè)定3次。(2)載藥及包封率:PTX-rHDL載藥量和包封率由高效液相色譜(型號(hào):1260,德國(guó)Agilent公司)測(cè)定,色譜柱為Zorbax C18 柱,流動(dòng)相為乙腈/水(52/48,v/v),PTX的保留時(shí)間為5.5min,測(cè)定波長(zhǎng)為227nm,按照中國(guó)藥典固體脂質(zhì)納米包封率及載藥量公式計(jì)算。載藥率(DLC)=PTX質(zhì)量/(PTX-rHDL微球質(zhì)量)×100%。包封率(EE)=PTX實(shí)際質(zhì)量/PTX的投料量(mg)×100%。(3)PTX-rHDL微球的粒徑和形態(tài)學(xué)通過透射電鏡(型號(hào):JEM-2010,日本電子株式會(huì)社)和動(dòng)態(tài)光散射儀觀察。

        1.3.3 藥物體外釋放觀察 將6ml PTX-rHDL微球置入透析袋(截留分子量為8 000~10 000Da),透析袋完全浸沒置入 80ml PBS[含 0.5%(w/v)Tween-80],在 37℃條件下,特定的時(shí)間點(diǎn)(30min 及 1、4、12、50、72、96h)取出4ml釋放介質(zhì),并替換相同體積的新的緩沖液。釋放介質(zhì)中的PTX含量由高效液相色譜法分析得,每個(gè)獨(dú)立樣本重復(fù)3次。

        1.3.4 不同胃癌細(xì)胞株蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN-45培養(yǎng)于含有10%FBS的1640培養(yǎng)液中,置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱(型號(hào):MCO-15AC,日本 SANYO公司),加入RIPA裂解液提取蛋白質(zhì),收集上清液后使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺電泳(Mini Protean 3 Cell,美國(guó)Bio-Rad公司),轉(zhuǎn)印于NC膜,先后加入一抗及二抗,應(yīng)用成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)(Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng),美國(guó)LI-COR公司)。其中一抗采用兔抗SR-B1抗體,二抗采用辣根過氧化物酶HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG。

        1.3.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 取10mg大豆卵磷脂溶解在2ml乙醇溶液中,加入0.01%NBD-PE,攪拌5min使其完全溶解,30℃恒溫下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑吹干制成均勻的脂質(zhì)薄膜,干燥 1h。加入 0.01M PBS(pH 7.4)10ml,水浴超聲5h(水溫控制在48℃以下)形成脂質(zhì)懸液,加入0.05mg Apo A-Ⅰ,上述溶液4℃保存過夜。再將該溶液置入透析袋浸入PBS中透析24h。以上操作均避光進(jìn)行。將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN-45以105密度接種在六孔板中(每孔8 000個(gè)細(xì)胞),在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后,去除培養(yǎng)液,每個(gè)孔加入200μl上述熒光微球孵育4h,PBS沖洗3次后在熒光顯微鏡(型號(hào):BX-51,日本Olympus公司)下觀察攝取情況。

        1.3.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用MTT法評(píng)估PTX裸藥、rHDL、PTX-rHDL微球?qū)GC-7901及MKN-45細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。具體步驟為:細(xì)胞以5 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔中,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,每孔再分別加入100μl濃度為8.75μg/ml的PTX裸藥、PTX-rHDL微球、以及含有相同量大豆卵磷脂的rHDL空白微球,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以加入0.9%氯化鈉溶液(NS)為對(duì)照組。與藥物作用48h后,每個(gè)孔中加入20μl 5mg/ml MTT,繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,棄去上清液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200μl,置震蕩儀上震蕩10min充分混勻,采用酶標(biāo)儀(型號(hào):ELX800,美國(guó)Biotek公司)630nm為參考波長(zhǎng),檢測(cè)490nm下吸光度(OD)。細(xì)胞的存活率(%)=(各實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。樣本重復(fù)3次。

        7.定期總結(jié),將同一類型的錯(cuò)題做好歸類,要學(xué)會(huì)使用標(biāo)簽或符號(hào),給相似類型的題、相關(guān)類型的題等做好標(biāo)記,以便于以后分專題復(fù)習(xí),很多學(xué)生最缺乏的就是這一步驟。其實(shí)在每周、每月、每季度、每年的定期整理歸納時(shí),可以專門留出錯(cuò)題本的前幾頁,方便后續(xù)做一個(gè)歸類整理的目錄,這樣,在翻錯(cuò)題本時(shí)就不至于茫然失措了。

        1.3.7 小鼠建模及分組 在小鼠右側(cè)腋下皮下注射SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)液0.5ml含2×106個(gè)細(xì)胞,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑,按照如下公式計(jì)算腫瘤體積:V=長(zhǎng)徑×短徑2/2。當(dāng)大部分小鼠腫瘤體積達(dá)到100~300mm3,分組評(píng)估PTX-rHDL較傳統(tǒng)化療藥物PTX是否有更好的抗腫瘤療效,以及空白rHDL是否具有抑瘤作用及生理毒性。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為PTX-rHDL組、PTX組、NS組、rHDL組,每組5只。分別于瘤周皮下給藥0.2ml PTX-rHDL微球(含PTX濃度為10mg/kg)、0.2ml PTX(10mg/kg)、0.2ml0.9%氯化鈉溶液、0.2m空白rHDL(空白微球濃度為100mg/kg)。每3d給藥1次,共5次。

        1.3.8 體內(nèi)抗腫瘤評(píng)價(jià) 在第1、4、8、11、19天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑,并稱量小鼠體重,計(jì)算相對(duì)腫瘤體積和相對(duì)小鼠重量。相對(duì)腫瘤體積=V/V0(V是測(cè)量時(shí)腫瘤絕對(duì)體積;V0是第1天該組腫瘤平均體積);相對(duì)小鼠體重=W/W0(W是測(cè)量時(shí)小鼠體重;W0是第1天該組小鼠平均重量)。第19天小鼠被處死,腫瘤取出稱重,并對(duì)各組小鼠的器官如心肝脾肺腎取出進(jìn)行石蠟包埋后HE染色作病理檢查,評(píng)估毒性。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 PTX-rHDL微球的合成和表征 大豆卵磷脂與PTX配比為質(zhì)量比10∶1時(shí),PTX-rHDL微球的穩(wěn)定性最高,粒徑在8d內(nèi)無明顯變化,見圖1。PTX-rHDL微球是直徑為(60.41±1.81)nm 球形粒子,見圖 2、3。載藥率和包封率分別為(3.86±0.90)%和(95.59±0.09)%。

        圖1 不同比重大豆卵磷脂/PTX微球的穩(wěn)定性

        圖3 PTX-rHDL粒徑分布

        2.2 PTX-rHDL微球體外釋放動(dòng)力學(xué) PTX-rHDL微球呈現(xiàn)先突釋后緩釋藥物的特征,在初始的4h內(nèi)釋放了17.55%,在24h內(nèi)共釋放了約25.00%的藥物含量,由此可以發(fā)現(xiàn),載入微球的PTX具有延遲釋放的效果,見圖4。

        圖4 PTX-rHDL的藥物釋放曲線

        2.3 不同胃癌細(xì)胞株SR-B1蛋白表達(dá) SR-B1蛋白在人胃癌SGC-7901細(xì)胞株高表達(dá),在MKN-45細(xì)胞株低表達(dá),見圖5。

        圖5 MKN-45和SGC-7901的SR-B1蛋白表達(dá)的電泳圖

        2.4 胃癌細(xì)胞株對(duì)PTX-rHDL微球的攝取 SR-B1表達(dá)陽性的胃癌SGC-7901細(xì)胞株攝取大量的熒光微球,而MKN-45細(xì)胞株不攝取,見圖6(插頁)。

        2.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn) SGC-7901和MKN-45細(xì)胞株的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1,SGC-7901細(xì)胞中PTX-rHDL組的細(xì)胞存活率低于PTX組、rHDL微球組及NS組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。對(duì)于MKN-45細(xì)胞中PTX組的細(xì)胞存活率低于PTX-rHDL組、rHDL微球組及NS組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。由表1可以看出:(1)對(duì)SR-B1表達(dá)陽性或者陰性細(xì)胞株的生存,rHDL無明顯影響;(2)PTX-rHDL微球?qū)Ω弑磉_(dá)SR-B1的細(xì)胞株的毒性強(qiáng)于低表達(dá)SR-B1的細(xì)胞株,并且比PTX裸藥殺傷作用更強(qiáng)。

        2.6 PTX-rHDL微球的體內(nèi)抗腫瘤作用 采用人胃癌細(xì)胞株SGC-7901小鼠皮下瘤模型來評(píng)價(jià)PTX-rHDL微球的體內(nèi)抗腫瘤作用。在第1、4、8、11、19天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑,根據(jù)上文公式計(jì)算相對(duì)腫瘤體積,并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。第19天時(shí),PTX組相對(duì)腫瘤體積為6.32,NS組相對(duì)腫瘤體積為10.32,PTX-rHDL微球組相對(duì)腫瘤體積為9.14。PTX-rHDL微球組與NS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PTX組與NS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能是因?yàn)楸狙芯恐惺褂昧溯^小劑量的PTX以及采用間隔給藥模式,見圖7。而在小鼠體重上,PTX組、PTX-rHDL微球組與NS組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖8。

        表1 不同藥物作用于SGC-7901和MKN-45細(xì)胞株后細(xì)胞存活率(%)

        圖7 4組小鼠的腫瘤體積曲線

        圖8 4組小鼠體重變化曲線

        所有小鼠在第19天被處死,每組的平均瘤重也被記錄并統(tǒng)計(jì)作為相對(duì)腫瘤體積的補(bǔ)充。PTX-rHDL微球組平均瘤重為(0.73±0.24)g,明顯小于NS組的(1.68±0.40)g(P<0.05),以及 rHDL 組(1.56±0.25)g(P<0.05)。PTX組平均瘤重為(1.46±0.32)g,低于 rHDL 組和 NS 組,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見圖9。小鼠瘤重結(jié)果與小鼠相對(duì)腫瘤體積結(jié)果一致。

        圖9 4組小鼠瘤重比較(注:與PTX-rHDL比較,*P<0.05)

        小鼠心、肝、脾、肺、腎組織切片HE染色結(jié)果顯示,無明顯的病理變化,見圖10(插頁)。初步證實(shí)了PTX-rHDL微球的體內(nèi)安全性。

        3 討論

        PTX作為廣譜抗癌藥物具有良好的抗腫瘤活性,但溶解度低這個(gè)特性限制了PTX的應(yīng)用。rHDL在結(jié)構(gòu)上、性質(zhì)上與人體內(nèi)源性HDL相似,具有粒徑小、生物相容性高、可與脂蛋白受體特異性結(jié)合等特點(diǎn),引起研究者們的廣泛關(guān)注,rHDL可以作為良好的藥物運(yùn)輸載體,搭載各類型的化療藥物、小干擾核糖核酸(siRNAs)、光敏劑和顯像劑等。

        本實(shí)驗(yàn)采用無毒無害的原料和方法制備了PTX-rHDL微球,形態(tài)規(guī)整,粒徑在60nm左右,具有良好的穩(wěn)定性,容易保存。該大小粒徑的微球易在組織內(nèi)擴(kuò)散,穿透血管內(nèi)皮進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。體外釋放試驗(yàn)顯示所制備的微球具有長(zhǎng)時(shí)的緩釋作用。SR-B1廣泛表達(dá)于多種惡性細(xì)胞表面,促進(jìn)其增殖和轉(zhuǎn)移。通過對(duì)SR-B1蛋白不同表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn),揭示該微球可以被SR-B1高表達(dá)的細(xì)胞株攝取,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,PTX-rHDL微球?qū)Ω弑磉_(dá)SR-B1的SGC-7901殺傷作用是裸藥PTX的1.5倍,而在SR-B1不表達(dá)的MKN-45細(xì)胞株,PTX-rHDL微球?qū)ζ錃饔眯∮赑TX裸藥,這證實(shí)了該微球的靶向性。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了PTX-rHDL微球可以明顯延緩腫瘤生長(zhǎng)。研究者們發(fā)現(xiàn)SR-B1可以作為一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物,即不包裹任何化療藥物,也可以減緩腫瘤的生長(zhǎng),對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用[15]。在本研究的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)rHDL組對(duì)細(xì)胞殺傷作用強(qiáng)于NS組,說明空白rHDL微球也有抗腫瘤趨勢(shì),然而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PTX-rHDL微球有良好的抑瘤效果,且不良反應(yīng)并無明顯增加,這符合當(dāng)代惡性腫瘤的治療理念。

        隨著生物化學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展,后續(xù)可將本實(shí)驗(yàn)室腫瘤穿透肽iRGD通過化學(xué)修飾到微球表面實(shí)現(xiàn)雙靶向,或者聯(lián)合放療研究有無協(xié)同增效等進(jìn)行更深入的探索。重組高密度脂蛋白微球作為藥物載體顯示出廣闊的應(yīng)用前景,為研究者們提供新思路和新方法。

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