劉延波 張世凱 趙志軍 王 賢 潘春梅

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品與生物工程學院〔酒業(yè)學院〕，河南 鄭州 450046；2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟學院河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046； 3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟學院鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046； 4. 賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300； 5. 河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵 476733)

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，具有悠久的歷史，其獨特的釀造工藝和特殊香味成分，在世界酒類產(chǎn)品中別有風味[1]。中國酒曲源遠流長，有學者[2]認為，制曲釀酒可與中國古代四大發(fā)明相媲美。釀酒微生物和酶的載體是大曲[3]，大曲內(nèi)部微生物種類錯綜復雜，主要包括三大類即霉菌、細菌和酵母菌[4]，淀粉酶(主要可以分為α-淀粉酶、β-淀粉酶和糖化型淀粉酶3種)、蛋白酶、纖維素酶和酯化酶等都是大曲中與釀酒有關的酶系[5]，另外酶可以將大分子營養(yǎng)物質分解成可以被微生物所利用的小分子物質，如氨基酸脫氫酶將氨基酸轉化為氨，然后3-羥基丁酮和氨通過縮合作用合成四甲基吡嗪[6]，直接參與獨特的風味物質形成；由此可見釀酒的出酒率和成品酒的質量與大曲酶系密不可分[4]。

在白酒釀造過程中，提高產(chǎn)淀粉酶菌株的作用可以提高淀粉原料的利用率和出酒率[7]。淀粉酶降解原料所產(chǎn)生的小分子糖類物質不僅是釀酒過程中各種微生物生長繁殖所需的碳源，而且小分子物質之間也會發(fā)生復雜的反應從而生成多種風味成分[8]。近年來，與白酒大曲微生物相關的研究逐漸增多，主要是對白酒大曲中微生物的品種、數(shù)目及其與白酒大曲理化性質關系的研究[9]，以及對白酒大曲中優(yōu)良菌株的選育等方面[10-11]。有關中原地區(qū)濃香型白酒大曲中高產(chǎn)淀粉酶菌株的研究未見報道。試驗擬以中高溫白酒大曲作為研究樣品，對成熟曲中高產(chǎn)淀粉酶的細菌進行分離鑒定并優(yōu)化產(chǎn)酶條件，為后續(xù)提高大曲液化力、糖化力提供菌種，以便有效控制制曲工藝與酒曲質量，以期對提升白酒品質和產(chǎn)量提供參照。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

中高溫白酒大曲：賒店老酒股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，20 g瓊脂，加水至1 L，121 ℃滅菌20 min[12];

種子培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，加水至1 L;

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，蛋白胨20 g，磷酸氫二鈉5 g，硫酸鎂0.1 g，氯化鈉0.1 g，pH 7.0[13]。

1.1.3 主要試劑、儀器

牛肉膏、蛋白胨：北京澳博星生物技術有限公司；

可溶性淀粉：天津市盛奧化學試劑有限公司；

瓊脂粉：天津市科密歐化學試劑有限公司；

磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸鎂：分析純，西隴化工股份有限公司；

柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒：天根生化科技有限公司；

振蕩培養(yǎng)箱：ZQLY-300S型，上海知楚儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9272型，上海一恒科學儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：LDZM-60KCS型，上海申安醫(yī)療機械廠；

分光光度計：722S型，上海菁華科技儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HHS-21-6型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

超凈工作臺：SW-CJ-2F型，蘇州凈化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

(1) 初篩：無菌環(huán)境中，采用分區(qū)方法稱取曲皮、曲心共5 g，研磨后加入45 mL無菌水振蕩30 min，用梯度稀釋法逐級稀釋后，依次得到不同梯度的稀釋液(10-2～10-6)。取10-5，10-6各100 μL稀釋菌懸液涂布在淀粉培養(yǎng)基上，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d[14]。對培養(yǎng)皿中生長出的單菌落進行碘熏，菌落周圍如果有白色透明圈出現(xiàn)，說明該菌株能生產(chǎn)淀粉酶[12]。

(2) 復篩：選取透明圈較明顯的菌株，用液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，然后以10%的接種量(250 mL三角瓶裝液量90 mL)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min，37 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用Yoo改良法[15]進行淀粉酶活力測定。結合透明圈直徑/菌落直徑(D/d值)與酶活力大小確定高產(chǎn)淀粉酶菌株。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察、分子鑒定及生理生化試驗

(1) 形態(tài)鑒定：將活化后的高產(chǎn)淀粉酶的菌株，用點接法接種到淀粉平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其形態(tài)特征并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

(2) 分子生物學鑒定：利用柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，提取復篩得到的高產(chǎn)菌株的基因組DNA，并以獲得的DNA為模板，用細菌16S rDNA通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATAGAGTTTGATC-3')/1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')為上/下游引物進行PCR擴增。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃修復延伸10 min，4 ℃下保存。PCR擴增反應體系(50 μL)：Mix 25 μL，DNA樣品1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，蒸餾水20 μL。

應用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。序列結果采用NCBI在線工具Blast在GeneBank內(nèi)與標準菌株比對，找出與克隆子序列同源性最高的序列，根據(jù)其同源性構建系統(tǒng)發(fā)育樹并明確其分類地位。DNAMAN軟件對齊序列[16]，Mega 6.0軟件的鄰位法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

(3) 生理生化試驗：結合生理生化試驗結果參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]對高產(chǎn)淀粉酶菌株進行鑒定。

1.2.3 6-10菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

(1) 碳源對淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：在液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入2%不同碳源(蔗糖、葡萄糖、玉米粉、麩皮、可溶性淀粉)替換產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源成分，進行碳源優(yōu)化試驗[20]。

(2) 發(fā)酵時間對淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：取無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH為7，以10%的菌液接種量接種于三角瓶中進行37 ℃，150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2，3，4，5，6 d后取出，進行酶活力測定[20-21]，確定最優(yōu)發(fā)酵時間。

(3) 初始pH對淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：取無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基(初始pH分別為3，4，5，6，7)，以10%的菌液接種量接種于三角瓶中進行37 ℃，150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)2 d后取出，進行酶活力測定[22]，確定最優(yōu)初始pH。

(4) 接種量對淀粉酶菌株產(chǎn)酶能力的影響：取無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH為7，分別以4%，6%，8%，10%，12%的菌液接種量接種于三角瓶中進行37 ℃，150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)2 d后取出，進行酶活力測定[23]，確定最優(yōu)接種量。

(5) 響應面優(yōu)化試驗：在單因素試驗的基礎上，選取影響因素顯著的發(fā)酵條件，以酶活力為因變量，利用Design Expert 8.0.6軟件設計Box-Behnken試驗[24-25]，確定高產(chǎn)淀粉酶菌株的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合并進行實驗驗證。

2 結果與分析

2.1 菌株初篩

樣品經(jīng)涂布和多次純化后，進行固體碘熏蒸試驗(見圖1)。經(jīng)初步篩選共有100株菌株產(chǎn)生了透明圈，其中D/d值>2.5的菌株共有6株，分別命名為6-8、6-10、26、29、32、35；其中D/d值最大的為6-10(表1)。

2.2 淀粉酶活力測定

對6株菌株進行搖床發(fā)酵，采用Yoo改良法測定酶活，結果如表2所示。從表2可以得出，菌株6-10的酶活最大可達37.13 U/mL，與透明圈的有效值大小相符。李蘭等[12]從白酒大曲中分離出產(chǎn)淀粉酶細菌最高初始酶活為33.65 U/mL，唐麗江等[26]篩選的產(chǎn)酶活性最高的Pab03、Pab02枯草芽孢桿菌在未優(yōu)化前酶活力分別為31.33，21.52 U/mL，均低于試驗未優(yōu)化前菌株6-10的酶活。

表1 透明圈與菌落直徑Table 1 The diameter of colony and transparentcirde

圖1 淀粉酶菌株產(chǎn)生的透明圈Figure 1 The transparent ring produced by the amylase strain

表2 粗酶液酶活力測定結果Table 2 The determination result of enzyme activity in impure enzyme liquid U/mL

2.3 高產(chǎn)淀粉酶細菌的形態(tài)與分子學鑒定及生理生化試驗

2.3.1 形態(tài)鑒定 將菌株6-10活化后在淀粉平板培養(yǎng)基上點接觀察其菌落形態(tài)特征(見圖2)。菌落顏色為乳白色，表面濕潤較稠密，粗糙且邊緣不規(guī)則有皺紋，菌落呈圓形中間凹陷呈火山口狀。進行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察其細胞形態(tài)(見圖3)。菌體呈紅色，為革蘭氏陰性菌，細胞形態(tài)為短桿狀。

圖2 6-10菌落形態(tài)圖Figure 2 Colony morphology of 6-10

2.3.2 分子生物學鑒定 提取6-10菌株的16S rDNA，PCR擴增電泳檢測(見圖4)，將擴增的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索相似序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega 6.0軟件的鄰位法(見圖5)。

由圖4可知，基因組DNA進行PCR擴增后，得到1 500 bp 的目的DNA片段。

由圖5可知，菌株6-10與Bacillusvelezensis同源性為99%，鑒定菌株6-10為芽孢桿菌屬。

2.3.3 生理生化試驗 如表3所示，6-10菌株可水解淀粉、甲基紅、明膠，不能產(chǎn)氨、抗酸、反硝酸化。結合生理生化試驗結果和16S rDNA分子鑒定，可確定6-10為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

圖3 6-10革蘭氏染色細胞形態(tài)Figure 3 6-10 Gram stained cell morphology (×1 000)

圖4 PCR擴增電泳檢測Figure 4 PCR amplification electrophoresis

圖5 菌株6-10系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Strain 6-10 phylogenetic tree

表3 6-10菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of the strain

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個新種[27-28]，不僅具有較強的產(chǎn)淀粉酶能力，而且可以水解淀粉、血液、明膠等，目前對其產(chǎn)淀粉酶能力尚未見深入研究。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)在農(nóng)業(yè)上還有促使植物生長和抵抗病原微生物作用，在提高糧食產(chǎn)量、質量和生物農(nóng)藥開發(fā)應用上潛力無窮[29]。

2.4 6-10菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗結果 由圖6可知，6-10菌株的最適碳源為可溶性淀粉，最適發(fā)酵時間為4 d，最適初始pH為4，最適接種量為10%。

2.4.2 Box-Behnken設計與結果 在單因素試驗的基礎上，選取發(fā)酵時間、初始pH、接種量3個具有顯著影響的因素作為自變量，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，設計了17個試驗點的響應面分析試驗。試驗因素水平見表4，試驗設計與結果見表5。

采用Design Expert 8.0.5軟件對表5數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到酶活對自變量發(fā)酵時間、初始pH、接種量的多元回歸方程為：

Y=164.46+8.28A+3.22B-0.97C+19.91AB-5.49AC+4.8BC-22.41A2-22.62B2-3.65C2。

(1)

由表6可知，回歸模型F值為22.4，且顯著性檢驗為極顯著(P=0.000 2)，失擬項不顯著(P=0.112 4>0.05)，說明該模型真實。回歸方程決定系數(shù)R2=0.966 4，表明響應值+酶活真實值與預測值之間具有較好的擬合度和可靠度，該方案是可行的。

2.4.3 酶活的響應曲面分析 圖7為發(fā)酵時間、初始pH、接種量3個因素兩兩之間交互作用對淀粉酶菌株酶活的影響。

由圖7可知，發(fā)酵時間和初始pH兩兩之間存在顯著的交互影響，發(fā)酵時間和接種量、初始pH和接種量存在交互影響，證明了響應面曲線分析結果的切實性。

表4 Box-Behnken試驗因素水平設計表Table 4 Box-Behnken horizontal design table of experimental factors

圖6 6-10菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化單因素試驗結果Figure 6 Single factor test results of optimized enzyme production conditions of strain 6-10

表5 Box-Behnken試驗設計與結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

2.4.4 發(fā)酵最佳條件確定及實驗驗證 采用Design Expert 8.0.5軟件優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，分析結果為：發(fā)酵時間4.29 d，pH 5.17，接種量9.52%。此條件下，模型預測值酶活為165.98 U/mL。為驗證響應面法所得預測值的可靠性，采用上述試驗條件進行發(fā)酵的工藝驗證，考慮到試驗中實際操作的方便，將最佳條件修改為發(fā)酵時間4 d，pH 5，接種量10%，經(jīng)過實驗驗證得到的酶活平均值為(164.37±3.25) U/mL，與預測值基本靠近，說明所建模型擬合優(yōu)良且真實。

表6 響應面回歸方程的方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

圖7 發(fā)酵時間、初始pH、接種量3個因素兩兩之間交互作用對淀粉酶菌株酶活的影響Figure 7 Effect of interaction between three factors, namely fermentation time, initial pH and inoculum, on enzyme activity of amylase strain

3 結論

試驗從大曲中篩選產(chǎn)淀粉酶細菌，利用透明圈和Yoo改良法測定酶活，選出高產(chǎn)菌株6-10，結合形態(tài)觀察和16S rDNA同源序列分析以及生理生化試驗對菌株進行鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，通過單因素與響應面試驗得到6-10最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時間4 d，pH 5，接種量10%。優(yōu)化后產(chǎn)酶能力達到(164.37±3.25) U/mL是優(yōu)化前酶活37.13 U/mL的4.43倍，具有較強的產(chǎn)淀粉酶能力。

試驗僅研究了貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的高產(chǎn)淀粉酶能力，后續(xù)將對其他性能進行深入研究，進一步發(fā)掘其應用潛力。