朱明靜 張清彬

廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院顳下頜關節(jié)科，廣州口腔疾病研究所，口腔醫(yī)學重點實驗室 廣州 510140

關節(jié)軟骨缺損可能是創(chuàng)傷性、退行性疾病或是全身免疫性疾病的結果，常常導致關節(jié)炎和退行性功能逐漸喪失，影響全世界數(shù)百萬人[1-2]。成人關節(jié)軟骨顯示出較差的自我修復能力，而且創(chuàng)傷后關節(jié)軟骨的愈合能力有限[3]。臨床研究[4]已經(jīng)探索了各種促進軟骨修復的方法，如磨損關節(jié)成形術、微骨折軟骨成形術、骨膜移植、自體軟骨細胞移植、骨軟骨移植和嵌入式膠原基質。

目前不同來源的間充質干細胞已被研究，甚至應用于臨床。由于其優(yōu)異的增殖及向骨、軟骨、肌肉等的分化能力[5]，間充質干細胞是用于再生醫(yī)學較有吸引力的細胞來源。間充質干細胞存在于各種組織中，例如骨髓、脂肪組織、肌肉、肝臟、真皮、滑膜組織等?；诖?，間充質干細胞有望用于軟骨修復[2]。然而，需要發(fā)現(xiàn)更多可重復一致的方法以有效誘導這些干細胞系中軟骨的形成。在這些干細胞系中誘導軟骨形成的方法包括合適的顆粒/基質組合物、軟骨分化培養(yǎng)基、低氧張力和其他一些形式的機械負荷[6-7]。

本綜述將重點介紹可溶性生長因子對間充質干細胞的三維體外軟骨誘導作用，尤其是轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族[3]，其中包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和BMP-9。同時，還有其他生長因子，包括成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）-2、糖皮質激素（glucocorticoid，GC）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）-1[8]。

1 間充質干細胞

間充質干細胞是一種多能干細胞，能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞、內皮細胞、脂肪細胞和肌原細胞[3]。Bernardo等[9]首先在間充質干細胞中觀察到軟骨形成。Steadman等[10]首先描述了間充質干細胞的體外軟骨形成確定的培養(yǎng)基。此外，已顯示這些細胞在骨和軟骨穩(wěn)態(tài)中起作用。因此，基于體外觀察，間充質干細胞可分化為成軟骨細胞并且易于增殖和獲得，這些細胞被視為軟骨工程中較有吸引力的候選者。

間充質干細胞最初可以從骨髓或其他組織分離[11]。在妊娠早期和妊娠中期的胎兒組織（例如肺、骨髓、肝和脾）中已鑒定出間充質干細胞。在自體細胞療法中，由于易獲得和潛在的自體應用，骨髓來源的間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell）和脂肪組織來源的間充質干細胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell）成為間充質干細胞的主要來源。許多研究表明，骨髓來源的間充質干細胞與脂肪組織來源的間充質干細胞具有相似的特征，包括形態(tài)學和細胞表面標志物，但已發(fā)現(xiàn)其生長和分化能力存在顯著的生物學差異，特別是在控制間充質干細胞分化和增殖的重要因素表觀遺傳調節(jié)機制方面。

到目前為止，DNA甲基化和組蛋白修飾是最重要的表觀遺傳調控方式，具有控制分化或維持間充質干細胞自我更新的能力。已知在啟動子區(qū)或第一外顯子中，CpG島的甲基化狀態(tài)的變化與相應基因的表達成反比。與胚胎干細胞和分化細胞中的二價位點不同，骨髓間充質干細胞中的二價位點DNA甲基化程度通常較低，可以進一步甲基化或活化。Trip10啟動子內的靶向DNA甲基化已被證明可加速間充質干細胞向神經(jīng)元或骨細胞分化。Xu等[12]確定了間充質干細胞命運的表觀調節(jié)作用，其研究結果顯示，從骨髓或脂肪組織獲得的表觀遺傳記憶有利于間充質干細胞沿成骨細胞或脂肪細胞譜系分化。在骨髓來源的間充質干細胞中，Runt相關轉化因子（Runt-related transcription factor，Runx）2啟動子的CpG位點呈低甲基化狀態(tài)，而在脂肪組織來源的間充質干細胞中呈高甲基化狀態(tài)。在脂肪組織來源的間充質干細胞中，過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）γ啟動子的CpG位點呈低甲基化狀態(tài)，而在骨髓來源的間充質干細胞中呈高甲基化狀態(tài)。在骨髓來源的間充質干細胞中，SOX（SRY-related high mobility group-box gene）-9啟動子的甲基化狀態(tài)僅略低于脂肪組織來源的間充質干細胞。故控制間充質干細胞命運的主要轉錄因子的甲基化狀態(tài)有助于不同來源的間充質干細胞的差異分化能力。

口腔來源的牙源性間充質干細胞（dentalderived mesemchyal stem cell）有牙髓干細胞（dental pulp stem cell）、脫落乳牙干細胞（stem cell from exfoliated deciduous teeth）、牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cell）、根尖乳頭干細胞（stem cell from apical papilla）和牙濾泡祖細胞（dental follicle progenitor cell）。牙組織是特殊的組織，不像骨組織那樣持續(xù)重塑。因此，與骨髓來源的間充質干細胞相比，源自牙組織的干細胞/祖細胞的分化潛能可能更高。牙髓干細胞較多與支架材料（如水凝膠、殼聚糖/藻酸鹽等）結合用于軟骨向分化[13-14]。同時，牙髓干細胞在體外有與骨髓來源的間充質干細胞共享相似的蛋白質表達模式，但成軟骨形成潛能很弱；相反，牙源干細胞的神經(jīng)源性可能比骨髓來源的間充質干細胞更有力，這很可能與它們的神經(jīng)鞘起源有關。脫落乳牙干細胞成軟骨也得到證明，但在成骨和表達神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞標記方面能力較弱。其余類型細胞也在成骨、成纖維等方面能力較強[14]。

2 生長因子

來自軟骨組織工程的可溶性因子可以通過設定低水平的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IGF-1和高水平的IGF-2、FGF-2、FGF-4在成軟骨培養(yǎng)基中獨立地誘導間充質干細胞成軟骨向分化[15]。

TGF-β超家族的大多數(shù)成員在軟骨組織中表達，并可能影響軟骨形成和生長的骨骼組織發(fā)生。TGF-β在體外可促進在早期未分化的間充質干細胞培養(yǎng)物中形成軟骨，并在體內刺激成軟骨向分化。TGF-β還刺激膠原合成和成骨細胞樣細胞的趨化性，并促進體內神經(jīng)支配后軟組織傷口的愈合。TGF-β在骨折修復的所有階段均表達，外源性TGF-β在骨修復過程中對基因表達以及軟骨和骨細胞的分化具有顯著影響[16]。

IGF-1被認為是影響軟骨發(fā)育、增長和體內平衡的關鍵因素之一。IGF-1水平的降低可能因關節(jié)炎時軟骨細胞募集減少而導致嚴重的骨關節(jié)炎。一些研究表明，IGF-1在三維基質或微團培養(yǎng)物中維持分化的骨間充質細胞和骨膜細胞的分化表型和軟骨形成能力的同時，增強了軟骨細胞的代謝。同時體外研究[17]也表明，IGF-1可在獨立于TGF-β的情況下誘導成軟骨向分化，但分化潛能稍弱于后者。

在FGF類家族成員中，F(xiàn)GF-2較多用于保持TGF-β1/BMP-2對間充質干細胞成軟骨分化潛能的協(xié)同作用，并減少不需要的肥大標志物[8]。TGF-β和BMP已被證實在誘導軟骨形成中起重要作用[18]。

然而，盡管這些生長因子對軟骨再生具有很大的治療潛力，但其在臨床治療中存在一些并發(fā)癥，而且劑量要求高、半衰期短、蛋白質結構不穩(wěn)定、使用成本高，以及存在形成肥大物質和炎癥因子等不良反應[19-21]。生長因子間的協(xié)同作用可適當減少并發(fā)癥的發(fā)生[4]。

3 三維培養(yǎng)體系

三維顆粒/基質培養(yǎng)體系被認為是成軟骨分化的重要方面[22-23]。據(jù)報道，在二維單層中培養(yǎng)的人間充質干細胞（human-derived mesenchymal stem cell）和人脂肪干細胞（human-derived adipose stem cell）相較于在三維基質或沉淀物培養(yǎng)條件下軟骨形成減少。據(jù)認為，細胞的沉淀或基質提供了一種與胚胎發(fā)育過程中軟骨前凝固相似的環(huán)境，在此過程中細胞呈球形[15,24-25]。顆粒系統(tǒng)最初用于預防軟骨細胞的表型調控和研究生長板軟骨細胞的終末分化。最常報道的粒徑范圍為包含2×105～2.5×105個細胞，但也有報道[26]可高達包含5×105個細胞。

基于基質的系統(tǒng)通常包括藻酸鹽和瓊脂糖。這些凝膠不能長時間穩(wěn)定地支持人間充質干細胞。據(jù)報道，在存在TGF-β3的情況下，人間充質干細胞接種的藻酸鹽珠構建體導致人間充質干細胞上調Ⅹ型膠原。相反，通過離心將人間充質干細胞轉化為沉淀，孵育于合并TGF-β3和地塞米松的環(huán)境中，未檢測到Ⅹ型膠原的上調。

Zhang等[27]在間充質干細胞軟骨形成過程中，證明了微團培養(yǎng)體系比標準的顆粒培養(yǎng)體系更有效。此外，間充質干細胞在微團培養(yǎng)條件下，在成軟骨向分化過程中上調了Ⅹ型膠原和Ⅰ型膠原的表達，表明誘導的軟骨更類似于透明軟骨。這些發(fā)現(xiàn)表明，微團培養(yǎng)系統(tǒng)是研究人間充質干細胞中軟骨形成潛力的有前景的工具。然而，單獨的三維培養(yǎng)環(huán)境不能維持延長軟骨形成。生長因子和適當?shù)奈锢泶碳な钦T導和防止軟骨細胞繼續(xù)分化為肥大細胞所必需的。

4 間充質干細胞成軟骨向分化中的生長因子

4.1 TGF-β在間充質干細胞成軟骨向分化中的作用

TGF-β是一種多功能肽。已證明生長因子家族的成員在骨和軟骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用[20]。TGF-β超家族的成員對于恢復和維持軟骨形成表型以及誘導來自不同來源的間充質干細胞的成軟骨向分化特別重要[28-30]。TGF-β亞型對軟骨細胞和其他細胞有不同的影響。

TGF-β3是目前被公認在成軟骨分化中較有效的生長因子[31]。Renner等[32]認為TGF-β3是一種有效的軟骨形成誘導劑。在早期人間充質干細胞形成軟骨的培養(yǎng)基配方中，TGF-β3便是組成成分，并且顯示出比TGF-β1更強烈的促進基質產(chǎn)生的作用。在生長因子TGF-β家族成員中，TGF-β2和TGF-β3在促進軟骨形成方面比TGF-β1更有效，導致更早和更廣泛的糖胺聚糖累積以及Ⅱ型膠原沉積[20,33]。而Goessler等[34]證明，在軟骨細胞去分化中，TGF-β1連續(xù)表達，而TGF-β2從未表達。TGF-β受體（TGF-β receptor，TGF-βR）Ⅲ連續(xù)表達，而TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ從未表達。然而，軟骨細胞外基質的許多沉積成分是通過暴露于TGF-β3的間充質干細胞而形成的，包括聚集蛋白聚糖、連接蛋白、纖維調節(jié)素、軟骨寡聚基質蛋白、核心蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和軟骨粘合素。軟骨細胞和其他幾種類型細胞產(chǎn)生TGF-β，作為與潛在的同型二聚體和潛在的TGF-β結合蛋白（latent transforming growth factor beta binding protein，LTBP）相關的大分子。

在生長板軟骨細胞中，LTBP對TGF-β的儲存具有細胞成熟依賴性。已知LTBP有4種不同的型，即LTBP-1、LTBP-2、LTBP-3和LTBP-4。編碼LTBP-1和LTBP-2的基因通過連續(xù)去分化激活，而編碼LTBP-3的基因連續(xù)表達，并且獲得編碼LTBP-4基因的陰性表達結果。

在軟骨形成分化過程中，間充質干細胞連續(xù)表達TGF- β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β4，而LTBP-1，LTBP-2表達下調。但是，Goessler等[34]的研究表明，TGF-β3、TGF-β4、TGF-β1、LTBP-1和LTBP-2可能有助于去分化過程，而TGF-β1和TGF-β2可能不參與這一過程。在TGF-βR中，只有TGF-βRⅢ可能參與去分化[33]。

4.2 BMP在間充質干細胞成軟骨向分化中的作用

BMP被認為是誘導間充質干細胞成軟骨向分化的生長因子。一些報道通過免疫組織化學和合成軟骨的大小和重量檢測說明了BMP對成軟骨向分化的影響。在已經(jīng)鑒定出的20種哺乳動物的BMP中，僅顯示3種Ⅰ型和3種Ⅱ型受體與BMP結合。結合BMP，導致Ⅰ型和Ⅱ型受體在磷酸化之前發(fā)生二聚化，并通過Smad通路發(fā)出信號[18]。BMP調節(jié)軟骨和骨骼發(fā)育的各個階段。特別是在軟骨中，BMP參與軟骨形成的所有階段，其直接調節(jié)幾種軟骨細胞特異性基因的表達，并且對軟骨細胞增殖和基質合成具有強烈影響。BMP已被證明是軟骨和骨骼發(fā)育的關鍵調節(jié)因子，也在成人骨骼系統(tǒng)的修復和重塑中發(fā)揮作用[35]。

研究者[36-37]通過比較BMP-2、BMP-4以及BMP-6對間充質干細胞體外軟骨形成的影響，首次證明BMP-2在促進軟骨形成方面比BMP-6更有效。通過對近12 000個基因的微陣列分析和逆轉錄聚合酶鏈反應分析，確定在預期BMP-2的反應時間序列中有軟骨合成的關鍵基因表達。BMP-2被認為是體外培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞的一種強有力的軟骨形成劑，并在體內促進關節(jié)軟骨愈合[32]。

Majundar等[38]證明，BMP-2和BMP-9誘導了Ⅱ型膠原mRNA的表達，增加了聚集蛋白聚糖和軟骨寡聚基質蛋白的表達，這就提示了軟骨細胞分化。在使用BMP治療過程中，Ⅱ型膠原α1、聚集蛋白聚糖及SOX-9表達的轉錄因子表達增加。經(jīng)白細胞介素（interleukin ，IL）-1處理后，軟骨分化細胞SOX-9、Ⅱ型膠原α1和聚集蛋白聚糖的表達下降。去除IL-1并進一步添加BMP，可恢復軟骨細胞標志物的表達。

Renner等[32]研究了一種BMP衍生的短肽，它能促進少量膠原蛋白的生成，并在與BMP-2類似的水平上促進人間充質干細胞中糖胺聚糖的生成。與BMP-2不同的是，該BMP衍生肽促進基質積累，而不引起肥大標志物的廣泛上調，這使得該BMP衍生肽成為軟骨工程中分化人間充質干細胞的一個有價值的工具[39]。

4.3 其他生長因子在間充質干細胞成軟骨向分化中的作用

FGF參與血管生成和組織修復。有研究[38,40-41]比較了在補充和不補充FGF的情況下人間充質干細胞增殖的速率、沿著軟骨形成途徑體外分化的能力，以及基因表達譜系。在補充FGF的培養(yǎng)基中，增殖的人間充質干細胞比在對照條件下增殖的人間充質干細胞更小并且增殖更快。用FGF處理的細胞制備的軟骨形成培養(yǎng)物比用對照細胞制備的培養(yǎng)物更大并且含有更多的蛋白多糖。

FGF-2也被稱為堿性成纖維細胞生長因子，已用于許多祖細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中以刺激增殖。FGF-2在維持胚胎自我更新能力中起重要作用。新近研究[42]的結果表明，F(xiàn)GF-2對軟骨形成和軟骨缺損的修復具有特定的有益作用。Solchaga等[43]用含F(xiàn)GF-2的培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質干細胞，發(fā)現(xiàn)不僅增加了增殖速度，而且還成功地延遲了軟骨形成的喪失。

維生素D是一組脂溶性類固醇，負責增加腸道對鈣、鎂和磷酸鹽的吸收，以及具有其他生物效應。維生素D與維生素D受體的相互作用是骨代謝和鈣穩(wěn)態(tài)的關鍵介質，同時顯著促進細胞分化和抑制細胞增殖。維生素D可以促進間充質干細胞增殖、移植和軟骨分化[44-46]。

糖皮質激素已被證明可促進成骨細胞和軟骨細胞的分化，是人間充質干細胞軟骨形成和成骨分化所必需的[47]。這些觀察結果表明，生理性糖皮質激素可能參與體內軟骨細胞的增殖和分化，并且糖皮質激素可通過作用于成體間充質祖細胞而影響體內的骨骼功能。但是，糖皮質激素在這一過程中的確切作用機制尚不清楚。Derfoul等[48]研究了在存在或不存在地塞米松、TGF-β或地塞米松+TGF-β的情況下，地塞米松對人間充質干細胞軟骨形成和分化的影響，結果表明，糖皮質激素是成人間充質干細胞中軟骨形成分化的關鍵調節(jié)因子。

4.4 生長因子在軟骨形成過程中的相互作用

在軟骨內骨化過程中，BMP和TGF-β信號通路可以在體內拮抗軟骨細胞的增殖和分化。在ATDC5細胞軟骨形成中，TGF-β能夠增強BMP信號傳導，而BMP-2能夠顯著降低TGF-β信號傳導。間充質干細胞也是如此[37]。

通過循環(huán)加入生長因子以誘導間充質干細胞軟骨形成和分化的循環(huán)模式是用于組織工程細胞誘導的有效方式。Indrawattana等[49]結合生長因子TGF-β3和BMP-6或TGF-β3和IGF-1，證明了它們對于誘導軟骨形成更有效，表明BMP-6和IGF-1信號傳導可以增強TGF-β3誘導的間充質干細胞軟骨的形成。

此外，F(xiàn)ukumoto等[50]的研究表明，IGF-1和TGF-β1組合可以起作用，調節(jié)骨軟骨細胞增殖和分化過程中骨膜間充質細胞的變化。TGF-β1早期起作用誘導軟骨形成，而IGF-1增強并維持增殖，增加軟骨的整體形成。

Renner等[32]觀察到，當BMP-2與TGF-β3組合時，軟骨形成或協(xié)同反應增強。TGF-β1還可通過調節(jié)ERK/JNK途徑參與維生素D誘導的骨髓來源的間充質干細胞成軟骨向變化。

Hara等[51]發(fā)現(xiàn)醋酸氟輕松與TGF-β3結合并強烈增強人骨髓間充質干細胞的成軟骨向分化。結果顯示醋酸氟輕松具有增強TGF-β3相關軟骨形成的獨特能力，并且醋酸氟輕松/TGF-β3組合可用作體外軟骨形成的主要誘導物。此外，醋酸氟輕松/TGF-β3有可能用于臨床，以提高基于干細胞的成軟骨向分化的再生方法的效率。

5 結語

為了開發(fā)誘導間充質干細胞形成軟骨的可再現(xiàn)方法，有必要分析增殖培養(yǎng)基、顆粒/基質組合物、軟骨分化培養(yǎng)基、氧張力和適當?shù)臋C械環(huán)境。

本綜述著重于成軟骨向分化培養(yǎng)基中的一個組成部分可溶性誘導生長因子，以分析對已知不同生長因子在間充質干細胞中誘導軟骨形成作用的理解。

研究結果已顯示，三維顆粒/基質系統(tǒng)在間充質干細胞成軟骨向分化中起重要作用。分析TGF-β超家族的表達級聯(lián)將極大地幫助確定各種生長因子影響間充質干細胞基因表達的機制。然而，這些序列的復雜性要求目前研究采用鈍性方法進行軟骨形成。因此，比較生長因子組合的系統(tǒng)是確定如何在這些干細胞中始終如一地和最佳地誘導軟骨形成的關鍵。生長因子可以單獨誘導特定的特征，它們結合起來可能促進和/或抑制其他的特征。

此外，還關注到已知的生長激素用于成軟骨向分化培養(yǎng)基以誘導間充質干細胞軟骨形成，似乎較有效誘導間充質干細胞中形成軟骨的因子包括地塞米松、TGF-β3、BMP-2、BMP-6和FGF。鑒于此，TGF-β超家族的其他成員誘導軟骨形成的事實表明，它們在一定程度上也可以發(fā)揮軟骨形成作用。