楊葉青 陳明 吳補(bǔ)領(lǐng)

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 廣州 510515

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類特殊的非編碼RNA，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。與線性RNA相比，circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可抵抗RNA酶R的消化，因而不易被降解，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[1]。除此之外，circRNA還具有分布廣泛、高保守性、組織細(xì)胞表達(dá)特異性等特征[2-3]。在某些特定情況下，circRNA的表達(dá)豐度超過了相關(guān)線性信使RNA（messenger RNA，mRNA）豐度的10倍之多。因而circRNA被認(rèn)為是理想的疾病診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，具有非常重要的研究意義及臨床應(yīng)用價(jià)值[4-5]。circRNA對干細(xì)胞的多向分化及維持細(xì)胞的多潛能狀態(tài)也起著重要的調(diào)控作用。在干細(xì)胞的分化、免疫和炎癥反應(yīng)中都發(fā)現(xiàn)了特異表達(dá)的circRNA。不同研究表明，circRNA可調(diào)控胚胎干細(xì)胞的多能性及分化能力，并且可以誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的形成。隨著對circRNA生物學(xué)功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)circRNA在多種復(fù)雜疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中可發(fā)生特異性表達(dá)，這些疾病包括動脈粥樣硬化、帕金森病、阿爾茨海默病、肌強(qiáng)直營養(yǎng)不良、糖尿病以及各類腫瘤[6-11]。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，取決于局部微環(huán)境的刺激，間充質(zhì)干細(xì)胞可產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)，具有造血支持、提供營養(yǎng)、激活內(nèi)源性干/祖細(xì)胞、組織損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)血管新生、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化、抗纖維化以及歸巢等多方面的作用。多種組織和器官中間充質(zhì)干細(xì)胞含量豐富，如骨髓、脂肪、牙髓、臍帶和胎盤等[12-13]。已證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞具有成骨向分化特性，但間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨向分化過程中的作用機(jī)制尚不明確，本文重點(diǎn)介紹了目前研究發(fā)現(xiàn)的circRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化作用中的機(jī)制。

1 circRNA在牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化中的作用

牙源性干細(xì)胞具有優(yōu)越的干細(xì)胞特性，可以從醫(yī)療廢棄物（如正畸需要拔除的牙、智齒等）中獲得，包括牙髓干細(xì)胞、脫落乳牙牙髓干細(xì)胞、牙根尖乳頭干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞以及牙囊前體細(xì)胞等[14-15]。Laino等[16]成功在體外使用牙髓干細(xì)胞形成新鮮自體骨，將新鮮自體骨植入鼠皮下4周后，其成功改建為板層骨。Amir等[17]的研究表明，犬牙周膜干細(xì)胞能夠修復(fù)直徑10 mm以下的頜骨缺損。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)，脫落乳牙牙髓干細(xì)胞在植入免疫缺陷動物后，能在老鼠腦組織中生存和遷移，并且能夠在體內(nèi)產(chǎn)生非板層骨和牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。因此，明確牙源性干細(xì)胞成骨向分化的調(diào)控機(jī)制，將有助于進(jìn)一步優(yōu)化基于干細(xì)胞的組織再生治療，為實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)和思路。Bahn等[19]發(fā)現(xiàn)，circRNA可能與口腔環(huán)境中的一些炎癥性疾病有關(guān)。

1.1 在牙周膜干細(xì)胞成骨向分化中的作用

張雄等[20]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA8433在人牙周膜干細(xì)胞成骨向誘導(dǎo)21 d后顯著高表達(dá)，將來可能是人牙周膜干細(xì)胞成骨向分化新的生物學(xué)標(biāo)志物。Zheng等[21]用牙周膜干細(xì)胞礦化誘導(dǎo)3 d時(shí)發(fā)現(xiàn)，與未誘導(dǎo)細(xì)胞相比，共有118個(gè)circRNA存在差異表達(dá)；7 d時(shí)共有128個(gè)circRNA存在差異表達(dá)；14 d時(shí)有139個(gè)circRNA存在差異表達(dá)。在所有樣品中，僅約4%的circRNA以時(shí)間方式改變，同時(shí)動態(tài)表達(dá)在牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化和生物礦化過程中，表明circRNA可能在細(xì)胞成骨向分化和骨形成中起作用。差異表達(dá)的circRNA富集在細(xì)胞質(zhì)或膜結(jié)合的囊泡和細(xì)胞外基質(zhì)中，表明它們在調(diào)節(jié)細(xì)胞外囊泡的生物發(fā)生中的潛在作用。

Gu等[22]發(fā)現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)后，總共檢測到147個(gè)長鏈非編碼RNA、1 382個(gè)circRNA與148個(gè)常見微小RNA（microRNA，miRNA，miR）組合，并與744個(gè)mRNA競爭miRNA結(jié)合位點(diǎn)。預(yù)測這些mRNA參與了細(xì)胞成骨向分化、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、Wnt途徑和調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號傳導(dǎo)途徑?；趍iRanda預(yù)測，其中circRNA BANP和circRNA ITCH可能與miR-34a和miR-146a相互作用，通過MAPK途徑調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞成骨向分化。

近期研究[23]發(fā)現(xiàn)，機(jī)械加力組牙周膜干細(xì)胞與未加力對照組相比，2 678個(gè)circRNA差異表達(dá)，1 191個(gè)上調(diào)，1 487個(gè)下調(diào)。其中circRNA3140與miR-21高度廣泛相關(guān)，miR-21在機(jī)械力誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞成骨向分化中起關(guān)鍵作用。機(jī)械加力后的牙周膜干細(xì)胞中顯著下調(diào)的circRNA436與miR-107和miR-335都相關(guān)，而miR-107和miR-335與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路相關(guān)，表明circRNA436可能是機(jī)械力刺激下牙周膜干細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一；同時(shí)，根據(jù)基因本體論（gene ontology，GO）分析可知，差異表達(dá)的circRNA4004與細(xì)胞外囊泡外泌體有關(guān)，它提供了外胚層介導(dǎo)的骨組織工程成骨向分化模式[24-25]。差異表達(dá)的circRNA4214參與了轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路調(diào)控MAPK信號通路。眾所周知，MAPK信號通路有利于成骨細(xì)胞的增殖和分化。GO分析顯示，circ-RNA3140與Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路和核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路相關(guān)。TLR可通過激活NF-κB途徑影響人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的成骨潛能，并介導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境中的成骨向分化[26-28]。通過預(yù)測軟件分析可知，circRNA5331表現(xiàn)出與miR-204高度相關(guān)。2010年Huang等[29]已經(jīng)闡明miR-204可通過負(fù)調(diào)節(jié)Runt2來抑制間充質(zhì)祖細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨。Wang等[23]繼續(xù)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖預(yù)測可知，circRNA126、circRNA4045和circ-RNA4251可以分別與多種miRNA（包括miR-101、miR-335和miR-107）相互作用。而Wang等[30]和Zhang等[31]曾報(bào)道m(xù)iR-101和miR-335通過靶向Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路來調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化。

目前關(guān)于circRNA在牙周膜干細(xì)胞成骨向分化方面的研究主要集中在基因芯片和生物信息學(xué)分析水平，但也有少量研究進(jìn)行了機(jī)制方面的探討，內(nèi)源性競爭RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）代表一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，比miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為精細(xì)和復(fù)雜，涉及更多RNA分子（包括mRNA、miRNA和circRNA等）。Li等[32]檢測了成骨誘導(dǎo)期間牙周膜干細(xì)胞中circRNA CDR1as和miR-7的動態(tài)表達(dá)譜。在成骨誘導(dǎo)期間，CDR1as的表達(dá)逐漸上調(diào)，14 d后，其表達(dá)比初始水平高10倍以上；miR-7的表達(dá)在牙周膜干細(xì)胞中顯著下調(diào)。CDR1as的低表達(dá)和miR-7的過表達(dá)抑制了堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、茜素紅S染色和成骨基因的表達(dá)。miR-7的過表達(dá)顯著降低了含有生長分化因子（growth/differentiation factor，GDF）5的野生型而非突變體3"非翻譯區(qū)序列的熒光素酶報(bào)告載體的活性。GDF5的下調(diào)部分逆轉(zhuǎn)了miR-7抑制劑對成骨細(xì)胞分化的影響。隨后CDR1as或GDF5的下調(diào)抑制Smad1/5/8和p38促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，而miR-7的上調(diào)降低磷酸化Smad1/5/8和p38 MAPK的水平。因此牙周膜干細(xì)胞circRNA CDR1as可充當(dāng)miR-7抑制劑，引發(fā)GDF5的上調(diào)和隨后的Smad1/5/8和p38 MAPK磷酸化，以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化。

綜上，circRNA在牙周膜干細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制以及調(diào)控的多條途徑之間的關(guān)聯(lián)可能成為今后的研究熱點(diǎn)。

1.2 在牙乳頭干細(xì)胞成骨向分化中的作用

占云燕等[33]發(fā)現(xiàn)在經(jīng)礦化誘導(dǎo)的小鼠牙乳頭細(xì)胞中，獲得了4 064個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中上調(diào)的共3 255個(gè)，下調(diào)的共904個(gè)。對上調(diào)circRNA來源基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中很多基因與牙的發(fā)育過程及硬組織礦化相關(guān)，其中Ipo7與Smad1的核轉(zhuǎn)位有關(guān)。Smad1為牙發(fā)育過程中起重要作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路的效應(yīng)分子，circRNA在成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程中有重要的調(diào)控作用。Setd2與組蛋白功能有關(guān)，在骨的重建中發(fā)揮重要作用。

新近研究[34]發(fā)現(xiàn)，根尖牙乳頭細(xì)胞在經(jīng)礦化誘導(dǎo)后，共有650個(gè)circRNA的表達(dá)顯著改變，其中317個(gè)circRNA下調(diào)，333個(gè)circRNA上調(diào)。通過京都基因與基因組百科全書KEGG和GO分析差異表達(dá)的基因，這些差異表達(dá)基因大多涉及Wnt信號通路、MAPK信號通路和其他一些與成骨相關(guān)的信號通路。隨后建立了成骨相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)，選出其中的circRNA NTATC1利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明其可促進(jìn)牙根尖乳頭干細(xì)胞的成骨向分化；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miR-4483的表達(dá)與circRNA NFATC1的趨勢呈負(fù)相關(guān)；利用circRNA數(shù)據(jù)庫circBase預(yù)測到miR-4483與circRNA NFATC1有結(jié)合位點(diǎn)，為牙根尖乳頭干細(xì)胞的成骨向分化提供了新的見解。

目前關(guān)于circRNA在牙乳頭干細(xì)胞成骨向分化中的功能及機(jī)制的探討較少，尚停留在小鼠模型研究及基因芯片和生物信息學(xué)分析水平，相信伴隨著新的研究技術(shù)體系的建立，circRNA在牙乳頭干細(xì)胞成骨向分化中的機(jī)制將進(jìn)一步闡明。

2 circRNA在非牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化中的作用

2.1 在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化中的作用

目前對非牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨向分化中circRNA的功能研究大多集中在骨髓來源的細(xì)胞，多為在骨質(zhì)疏松方面的功能及作用。

Li等[35]發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor，ER）β缺乏會抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化。沉默ERβ會使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的一些circRNA差異表達(dá)，并且成骨相關(guān)蛋白質(zhì)在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)下調(diào)。通過RNA-Seq分析檢測ERβ對circRNA表達(dá)的影響，146個(gè)circRNA存在差異表達(dá)，68個(gè)circRNA下調(diào)，78個(gè)circRNA上調(diào)。構(gòu)建circRNA-microRNA網(wǎng)絡(luò)表明，ERβ可以通過2:27713879|27755789/2:240822115|240867796-miR-328-5p-mRNA網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)成骨向分化。隨后相繼有學(xué)者發(fā)現(xiàn)circRNA在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化中有重要的作用，Zhang等[36]發(fā)現(xiàn)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化期間，與未分化細(xì)胞相比，第7 d時(shí)總共有3 938個(gè)circRNA上調(diào)，150個(gè)circRNA下調(diào)；大約95%的差異表達(dá)的circRNA來自編碼蛋白質(zhì)的基因，GO分析表明差異表達(dá)的circRNA的親本基因與成骨存在關(guān)聯(lián)；其中一些circRNA與具有成骨作用的miRNA存在關(guān)聯(lián)，表明這些circRNA可能在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化中起作用。circRNA IGSF11的沉默促進(jìn)了成骨細(xì)胞分化并提高了miR-199b-5p的表達(dá)水平，證明了circRNA-miRNA相互作用對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化有積極作用。趙可偉[37]通過circ-RNA芯片檢測絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者外周血單核細(xì)胞中circRNA的表達(dá)水平，檢測到11 246個(gè)circ-RNA；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組與非患病對照組相比，381個(gè)circRNA表達(dá)變化倍數(shù)≥1.5（P<0.05），其中203個(gè)上調(diào)、178個(gè)下調(diào)；其中circRNA0001275具有作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥生物標(biāo)志物的潛能。研究結(jié)果證明了circRNA在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。在防治骨質(zhì)疏松癥方面，Yin等[38]也發(fā)現(xiàn)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化過程中，circRNA RUNX2（circRUNX2）可以與miR-203結(jié)合并增強(qiáng)RUNX2的表達(dá)，抑制成骨向分化，因此證明circRUNX2可預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。

Yang等[39]發(fā)現(xiàn)，與非骨質(zhì)疏松癥患者相比，骨質(zhì)疏松癥患者血清中miR-217水平升高，血清circRNA VANGL1和RUNX2水平降低。circRNA VANGL1（circ-VANGL1）通過吸收miR-217來調(diào)節(jié)RUNX2表達(dá)，而加速成骨向分化。circ-VANGL1的過表達(dá)使與成骨相關(guān)的RUNX2、骨橋蛋白、骨涎蛋白、骨鈣蛋白的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，過表達(dá)circ-VANGL1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP活性增加。共同過表達(dá)circ-VANGL1和miR-217的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的ALP活性略微增加。Ren等[40]發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽（calcium gene-related peptide，CGRP）刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，有58個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNA，其中44個(gè)circRNA下調(diào)，14個(gè)circRNA上調(diào)；其中mmu_circRNA_003795顯著增加，而沉默mmu_circRNA_003795后，mmu_miR-504-3p的表達(dá)增加，F(xiàn)os樣抗原2表達(dá)和細(xì)胞增殖減少。上述結(jié)果證明了circRNA在CGRP誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖中有重要作用，確定circRNA涉及調(diào)節(jié)機(jī)制的部分，進(jìn)一步提供了研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化及增殖的能力的新方向。

2.2 在胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化中的作用

Qian等[41]通過RNA-seq分析不同成骨細(xì)胞分化階段circRNA的差異表達(dá)，鑒定circRNA19142和circRNA5846與成骨細(xì)胞分化有關(guān)，BMP2可通過circRNA9142/circRNA5846誘導(dǎo)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1158細(xì)胞的成骨向分化。

2.3 在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化中的作用

Long等[42]發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨過程中不同階段存在差異circRNA表達(dá)，共檢測到14 236個(gè)circRNA，其中有40個(gè)上調(diào)，circRNA通過干擾成骨相關(guān)的miRNA在成骨向分化中發(fā)揮重要作用；circRNA-miRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)顯示miR-338-3p與上調(diào)的circRNA13422及circRNA22566相關(guān)。circRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)對脂肪來源干細(xì)胞成骨向分化期間circRNA功能的確定有重要的價(jià)值。

3 circRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化中的作用研究展望

綜上所述，雖然目前涉及circRNA對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化方面的文獻(xiàn)較少，研究方法主要集中在基因芯片檢測以及生物信息學(xué)分析的層次上，對其相互作用的機(jī)制研究仍然欠缺，許多circRNA的生物學(xué)功能尚未得到闡明。從本文所述中可以看出，間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化會受到circRNA的調(diào)控，兼有抑制或促進(jìn)效應(yīng)；少量的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，circRNA與miRNA和mRNA關(guān)系密切，彼此相互作用，在人體內(nèi)構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜而精準(zhǔn)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，可能構(gòu)成了近年來探討較多的ceRNA的作用機(jī)制，circRNA可以結(jié)合某些miRNA以發(fā)揮分子海綿作用，調(diào)控宿主的基因表達(dá)[43]。關(guān)于circRNA對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的相關(guān)調(diào)控因素作用方面的研究有助于深入探究circRNA這一重要的非編碼RNA，也將有利于為間充質(zhì)干細(xì)胞的再生治療提供新的思路和方法。