石玉

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 成都 610041

骨是骨骼系統(tǒng)的核心組成部分，因結(jié)構(gòu)高度礦化而具有堅(jiān)固而穩(wěn)定的特性。骨骼的功能除保護(hù)重要器官以及幫助人體自由運(yùn)動(dòng)外，骨髓腔內(nèi)存在大量的生命活動(dòng)所必需的造血細(xì)胞；同時(shí)，骨骼可分泌調(diào)節(jié)碳水化合物和礦物質(zhì)離子代謝的激素，提供大量的鈣和磷酸鹽儲(chǔ)備，可用于調(diào)節(jié)全身性礦物質(zhì)離子穩(wěn)態(tài)。因此，骨骼結(jié)構(gòu)內(nèi)多種不同類型細(xì)胞相互作用，使骨骼具有眾多重要功能。骨骼細(xì)胞處于一個(gè)高度復(fù)雜、密閉的硬組織包圍的環(huán)境中，導(dǎo)致在技術(shù)和概念上嚴(yán)重制約了對(duì)其中各類細(xì)胞的研究。

骨骼干細(xì)胞是處于骨骼細(xì)胞分化鏈條上游的重要細(xì)胞群，其研究成為硬組織領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前，對(duì)骨骼干細(xì)胞尚無明確且統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)；骨骼細(xì)胞譜系的復(fù)雜性以及缺乏對(duì)骨骼干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的掌握，也阻礙了對(duì)這些重要細(xì)胞群的理解。不過可以確定的是，以往認(rèn)為一種或幾種類型的全能干細(xì)胞就可以協(xié)調(diào)骨骼發(fā)育和再生的想法并不準(zhǔn)確，當(dāng)前的觀點(diǎn)更支持多種不同類型的骨骼干細(xì)胞相互協(xié)作并共同分化形成骨組織。

1 骨骼發(fā)育

在骨骼系統(tǒng)中，最為主要的細(xì)胞類型是前成骨細(xì)胞（pre-osteoblast）、成骨細(xì)胞（osteoblast）、骨襯細(xì)胞（bone lining cell）以及骨細(xì)胞（osteocyte），這些細(xì)胞都是由骨骼干細(xì)胞（skeletal stem cell）分化形成的不同階段的骨骼譜系細(xì)胞（osteoblast lineage cell）[1]。目前公認(rèn)的觀點(diǎn)是，骨骼干細(xì)胞位于骨骼譜系細(xì)胞的上游，通過復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)控，形成這些前期或者終末分化狀態(tài)的細(xì)胞。目前所知的干細(xì)胞的特征是具有兩種重要功能：1）自我更新，即在保持其特性的同時(shí)進(jìn)行自我復(fù)制的能力；2）多向分化潛能，即向多種類型細(xì)胞分化的能力。骨骼在其整個(gè)生命周期中經(jīng)歷了許多生物學(xué)上重要的步驟，例如形態(tài)發(fā)生和發(fā)育、激增性增長(zhǎng)和功能成熟、穩(wěn)態(tài)維持以及組織結(jié)構(gòu)的再生與修復(fù)。在每個(gè)步驟中，骨骼干細(xì)胞都會(huì)提供新鮮的具有生物活性的骨細(xì)胞，保持骨骼的強(qiáng)度和功能。

在不同的胚胎期骨形成生理解剖位置，研究者發(fā)現(xiàn)顱頜面骨處的骨骼干細(xì)胞來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cell）；軀干骨處的骨骼干細(xì)胞來源于近軸中胚層（paraxial mesoderm）；四肢骨處的骨骼干細(xì)胞來源于側(cè)板中胚層（lateral plate mesoderm）。根據(jù)骨骼發(fā)育方式，骨形成可分為膜內(nèi)成骨（intramembranous ossification）和軟骨內(nèi)骨化（endochondral ossification）[2]。在傳統(tǒng)意義上，膜內(nèi)成骨是指骨骼干細(xì)胞聚集并直接形成骨細(xì)胞的過程，主要是顱頜面骨以及鎖骨的形成方式；軟骨內(nèi)骨化是指骨骼干細(xì)胞聚集形成軟骨組織和包圍在其外的軟骨膜細(xì)胞，軟骨細(xì)胞增殖進(jìn)而肥大，激活重要的分化信號(hào)通路[例如Indian Hedgehog（IHH）等]，隨后促進(jìn)軟骨膜細(xì)胞逐漸形成骨細(xì)胞，主要發(fā)生在四肢骨以及軀干骨部位[2]。在骨發(fā)育過程中，眾多轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮關(guān)鍵作用，比如軟骨形成過程中的Sox9基因，骨細(xì)胞早期的關(guān)鍵分子Osx、ATF4以及Runx2等。干細(xì)胞成骨分化過程又受到局部信號(hào)分子Wnt、Notch、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）以及Hedgehog通路調(diào)節(jié)；同時(shí)全身系統(tǒng)性的調(diào)控（如PTH、Fgf23等）也可以促進(jìn)骨-牙等硬組織形成[1]。

2 骨骼干細(xì)胞的傳統(tǒng)鑒定方式

基于恢復(fù)人體骨組織功能的再生醫(yī)學(xué)及組織工程學(xué)的發(fā)展大大地推動(dòng)了對(duì)于骨骼干細(xì)胞的研究。近年來，對(duì)于骨骼干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)來源于人類和嚙齒類動(dòng)物骨髓細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?！凹?xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定”以及“細(xì)胞異體移植至裸鼠體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)”已經(jīng)作為鑒定骨髓來源干細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。體外鑒定主要指研究細(xì)胞是否具有多向分化潛能以及克隆形成能力；異體移植檢測(cè)主要觀察細(xì)胞移植至裸鼠體內(nèi)后可否形成骨組織[3]。

發(fā)現(xiàn)骨髓中存在具成骨能力干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)要追溯到20世紀(jì)60年代。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)riedenstein等[4]發(fā)現(xiàn)將人類骨髓細(xì)胞皮下移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)時(shí)，這些細(xì)胞最終形成了包含微血管的小骨組織。隨后發(fā)現(xiàn)一種具有單克隆形成能力的成纖維樣細(xì)胞，命名為克隆形成單位-成纖維細(xì)胞（colony-forming unit fibroblast，CFU-F），其具有成骨向分化能力，也是異體移植后形成小骨組織的細(xì)胞來源[5]。與此類似，來自嚙齒動(dòng)物的骨髓細(xì)胞同樣具有相似的特性。當(dāng)時(shí)，學(xué)者們認(rèn)為存在于人和嚙齒動(dòng)物骨髓中的CFU-F是骨骼干細(xì)胞。盡管CFU-F在體外培養(yǎng)條件下普遍具有相似的克隆形成能力，但在基因表達(dá)和功能上具有高度異質(zhì)性。實(shí)際上，只有一部分CFU-F具有自我更新和多向分化能力，可以在體外多向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，或形成異體移植后的小骨組織[6]。根據(jù)目前的定義，骨骼干細(xì)胞其實(shí)僅僅是CFU-F的一個(gè)子集[7]。更為重要的是，單一克隆的CFU-F在移植到裸鼠體內(nèi)后，小骨形成的效率大大降低[6]，這表明不同的CFU-F之間可以相互依存，功能上可以相互補(bǔ)充，更有利于體內(nèi)重建造血微環(huán)境和骨組織，這是單一CFU-F無法實(shí)現(xiàn)的。

在供體體內(nèi)，無法直接區(qū)分CFU-F與骨骼干細(xì)胞，只能利用體外培養(yǎng)再通過異體移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)行清楚的鑒別，因此干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的引入為骨骼干細(xì)胞的鑒定提供了重要的研究手段。

3 骨骼干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物

長(zhǎng)期以來，單克隆抗體和流式細(xì)胞分選技術(shù)一直用于鑒定非培養(yǎng)狀態(tài)下的間充質(zhì)干細(xì)胞。在人類細(xì)胞中，細(xì)胞表面分子CD271被證明可以標(biāo)記所有3個(gè)胚層的細(xì)胞，包括非神經(jīng)細(xì)胞類型[8]。隨后，研究者[9]發(fā)現(xiàn)，CD271甚至在造血活動(dòng)出現(xiàn)之前就標(biāo)記了成人和胎兒骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞。在人類骨髓細(xì)胞中，CD271可以單獨(dú)或與其他細(xì)胞表面標(biāo)志物一起富集CFU-F[10-12]。

STRO-1抗體被發(fā)現(xiàn)可以鑒定和富集人源骨髓間充質(zhì)細(xì)胞[13]。

在Bianco團(tuán)隊(duì)[6]的一項(xiàng)重要研究中，細(xì)胞表面分子CD146被證明可以標(biāo)記處于骨髓中竇狀血管外膜上的網(wǎng)狀細(xì)胞（reticular cell），這些CD146陽(yáng)性細(xì)胞中富含CFU-F，并能夠在移植到裸鼠體內(nèi)后形成有血管存在的異位骨。更為重要的是，將這個(gè)異位骨組織進(jìn)行酶解、消化后，收集到的細(xì)胞可在體外培養(yǎng)并形成單克隆集落，從而證明了CD146陽(yáng)性細(xì)胞在體內(nèi)的自我更新能力[6]。進(jìn)一步的研究[14]表明，CD51、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）雙陽(yáng)性細(xì)胞只是CD146陽(yáng)性細(xì)胞中的一小部分，其具有更強(qiáng)的克隆形成能力。PDGFRα、干細(xì)胞抗原-1（stem cell antigen-1，Sca-1）雙陽(yáng)性非造血細(xì)胞（PαS細(xì)胞）在體內(nèi)位于血管周圍空間，同時(shí)在體外可以形成單克隆[15]。如果將這些細(xì)胞在非培養(yǎng)狀態(tài)下與造血干細(xì)胞共移植到受輻射照射的受體小鼠體內(nèi)，可以分化為成骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞；更重要的是這群細(xì)胞同樣高表達(dá)PDGFRα與Sca-1。這些結(jié)果表明PαS細(xì)胞在體內(nèi)具有自我更新的能力，是一群骨骼干細(xì)胞。

隨后的研究[16]表明，在人類骨髓中，CD271高表達(dá)的具有克隆形成能力的細(xì)胞在體外展現(xiàn)出多向分化潛能，并且在體內(nèi)可以分化為骨小梁區(qū)域的骨細(xì)胞。CD271、CD146雙陽(yáng)性細(xì)胞群體具有異體移植后成骨的特征。

其他實(shí)驗(yàn)[17]表明，CD271、Thy1（CD90）和VCAM-1（CD106）組合可富集CFU-F。此外，將未培養(yǎng)的CD271、Thy1雙陽(yáng)性細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)后，可以在其骨髓中檢測(cè)到這群細(xì)胞的存在，說明了這群細(xì)胞屬于骨骼干細(xì)胞。

此外，將骨小梁周圍結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）陽(yáng)性間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成的間充質(zhì)細(xì)胞移植到體內(nèi)，同樣具備干細(xì)胞特性[18]。最新的研究成果[19]顯示，在小鼠腿骨中，應(yīng)用CD51（αV integrin）、CD90（Thy）、CD105（endoglin）以及CD200（OX2）可以分離骨骼干細(xì)胞。在人體骨骼中發(fā)現(xiàn)的PDPN（Podoplanin）陽(yáng)性、CD146陰性、CD73陽(yáng)性、CD146陽(yáng)性的細(xì)胞為人源骨骼干細(xì)胞[20]。類似的，許多其他標(biāo)志物可以作為骨骼干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志分子，例如Sca-1以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。因此，將干細(xì)胞表面標(biāo)志物、細(xì)胞體外鑒定以及細(xì)胞異體移植實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的研究手段對(duì)骨骼干細(xì)胞的鑒定提供了更為全面的信息。

4 利用轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定骨骼干細(xì)胞

研究者也應(yīng)用遺傳學(xué)手段將特定的標(biāo)記分子（例如可表達(dá)特異顏色熒光蛋白的基因或編碼β-半乳糖苷酶的lacZ等）克隆到特異基因位點(diǎn)的3"端，并構(gòu)成新型轉(zhuǎn)基因小鼠。在這種轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，當(dāng)某種細(xì)胞表達(dá)特異基因時(shí)，該基因所連結(jié)的標(biāo)記分子也隨之表達(dá)，因而達(dá)到標(biāo)記這群細(xì)胞的目的。

使用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠是首先被用于研究骨髓多能間充質(zhì)干細(xì)胞的小鼠模型。在該模型內(nèi)，GFP的表達(dá)受到Nestin基因表達(dá)的調(diào)控[21]。Nestin是一種中間絲蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物。Nestin-GFP在圍繞骨髓小動(dòng)脈的細(xì)胞中高表達(dá)，而骨髓中的Nestin-GFP陽(yáng)性細(xì)胞具有克隆形成能力，可形成具有自我復(fù)制能力的“間充質(zhì)球”，并具有多次異體移植能力[22]。Nestin-GFP陽(yáng)性細(xì)胞中的CD51、PDGFRα雙陽(yáng)性亞群具有更強(qiáng)的克隆形成能力[23]。隨后，在Nestin-GFP標(biāo)記的細(xì)胞群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)2個(gè)不同的亞群，Nestin-GFP高表達(dá)的細(xì)胞亞群比較罕見，僅位于小動(dòng)脈周圍，具有更強(qiáng)的克隆形成能力且常常處于靜止?fàn)顟B(tài)；Nestin-GFP低表達(dá)的細(xì)胞亞群數(shù)量較多，呈網(wǎng)狀，主要分布在動(dòng)脈竇小血管附近，表達(dá)高豐度的瘦素受體（leptin receptor，LepR）[14]。

趨化因子（CXC基序）配體[chemokine （CX-C motif ）ligand，CXCL]12是趨化因子（CXC基序）受體[chemokine（C-X-C motif）receptor，CXCR]4的配體，在造血階段的初期和中期發(fā)揮重要作用[24-26]。在CXCL12-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，骨小梁上網(wǎng)狀細(xì)胞高表達(dá)GFP（代表高表達(dá)CXCL12），因此將該細(xì)胞群命名為CXCL12豐富網(wǎng)狀（CXCL12 abundant reticular，CAR）細(xì)胞；而在內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞中，GFP表達(dá)水平很低甚至檢測(cè)不到（代表CXCL12低表達(dá)）[25]。對(duì)CAR細(xì)胞的深層次研究[27]表明，該細(xì)胞群除表達(dá)常規(guī)骨骼干細(xì)胞的細(xì)胞表面分子（例如VCAM1、CD44、CD51、PDGFRα和PDGFRβ）外，還是干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）的主要分泌來源?；虮磉_(dá)分析表明，該群細(xì)胞在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出成骨向和成脂肪分化的能力。

圖1中,設(shè)定輸入光場(chǎng)為Ein,輸出光場(chǎng)為Eout,諧振腔內(nèi)耦合區(qū)域前后的光場(chǎng)分別為E1和E2,耦合區(qū)域的耦合系數(shù)和透射系數(shù)分別為k和t。k與t滿足k2+t2=1。輸出端的光功率為Iout=|Eout|2,輸出端的光功率為Iin=|Ein|2。φ代表諧振器的往返相位,L是諧振器周長(zhǎng),β是傳播常數(shù),φ=βL。那么反射式光波導(dǎo)諧振腔的傳遞函數(shù)表示為

5 利用體內(nèi)譜系追蹤方式鑒定骨骼干細(xì)胞

目前，研究特定細(xì)胞在體內(nèi)生理情況下的分化及維持的金標(biāo)準(zhǔn)是使用轉(zhuǎn)基因小鼠的譜系追蹤（lineage tracing）實(shí)驗(yàn)。使用該方法在體內(nèi)研究細(xì)胞譜系時(shí)，對(duì)機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生任何損傷，因此非常適合研究發(fā)育過程。

通常，譜系追蹤實(shí)驗(yàn)通過Cre-LoxP技術(shù)用生物系統(tǒng)永久性標(biāo)記感興趣的細(xì)胞。 Cre重組酶在第一個(gè)轉(zhuǎn)基因中以啟動(dòng)子/增強(qiáng)子特異性方式表達(dá)，并在第二個(gè)轉(zhuǎn)基因中作用于處于Rosa26基因座的報(bào)告基因位點(diǎn)。在該基因座中，包含polyA序列在內(nèi)的多個(gè)序列以及翻譯終止密碼子（“STOP”序列），阻止了報(bào)告基因的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些“STOP”序列的兩側(cè)是loxP位點(diǎn)，當(dāng)Cre重組酶作用于Rosa26基因座并除去“STOP”序列時(shí)，報(bào)告基因在特異性啟動(dòng)子的指導(dǎo)下表達(dá)，因此可以將表達(dá)特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

改良的譜系追蹤版本利用遺傳學(xué)手段將報(bào)告基因與Cre-ERT轉(zhuǎn)基因放在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)，這樣既可以保證報(bào)告基因在特定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（何處表達(dá)），又可以通過外源藥物控制基因在特定時(shí)間表達(dá)（何時(shí)表達(dá)）。Cre-ERT小鼠是一類可表達(dá)雌激素受體的配體結(jié)合區(qū)突變體（ERT）與Cre重組酶的融合蛋白的小鼠。在未受他莫昔芬（tamoxifen）誘導(dǎo)的情況下，Cre-ERT在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于無活性狀態(tài)；當(dāng)轉(zhuǎn)基因小鼠受他莫昔芬誘導(dǎo)后，他莫昔芬的代謝產(chǎn)物4-羥基他莫昔芬（雌激素類似物）與ERT結(jié)合，可使Cre-ERT進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮Cre重組酶活性。在體內(nèi)，他莫昔芬的有效時(shí)間有限，一般在24～48 h內(nèi)可以暫時(shí)激活CreloxP重組系統(tǒng)，然后逐漸被細(xì)胞清除。因?yàn)樵趫?bào)告基因位點(diǎn)發(fā)生的重組是不可逆的，即使驅(qū)動(dòng)Cre重組酶表達(dá)的啟動(dòng)子不再具有活性，只要表達(dá)Cre的細(xì)胞存活下來，報(bào)告基因就會(huì)在靶細(xì)胞及其后代中持續(xù)表達(dá)。這就是小鼠體內(nèi)譜系追蹤的簡(jiǎn)要工作原理。

目前，對(duì)于標(biāo)記分子已開發(fā)出了幾種版本、經(jīng)修飾的Rosa26報(bào)告基因等位基因，包括R26R-lacZ（編碼β-半乳糖苷酶）、R26R-YFP[編碼黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）]、R26R-tdTomato（編碼紅色熒光蛋白的串聯(lián)二聚體，DsRed）和R26R-Confetti。最后一個(gè)等位基因編碼4種不同的熒光蛋白，即核GFP、YFP、tdTomato和藍(lán)綠色熒光蛋白（blue-green fluorescent protein，CFP）。 應(yīng)該注意的是，每個(gè)版本都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，盡管R26R-Confetti等位基因提供了4種可能對(duì)體內(nèi)克隆分析有用的顏色，但是轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)的復(fù)雜性要求loxP切除和倒置，該等位基因?qū)re-loxP重組相對(duì)不敏感。

雖然利用體內(nèi)譜系追蹤技術(shù)研究干細(xì)胞還處在初期階段，但是越來越明顯的是，骨髓并不是骨骼干細(xì)胞所處的唯一環(huán)境，胚胎期也不是干細(xì)胞存在的唯一時(shí)期。在骨骼中的其他重要位置（例如骨膜和生長(zhǎng)板），在發(fā)育的不同時(shí)間段甚至是成體中，也存在著具有不同功能的骨骼干細(xì)胞亞群。

5.1 機(jī)體發(fā)育早期階段的骨骼干細(xì)胞鑒定

在發(fā)育的早期階段，局部的干細(xì)胞出現(xiàn)并分化成間充質(zhì)干細(xì)胞，隨后發(fā)生聚集和進(jìn)一步分化。在四肢發(fā)育過程中，骨骼細(xì)胞來源于側(cè)板中胚層。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子Prrx1在這些中胚層細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)這一時(shí)期的研究多應(yīng)用Prrx1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。其中Cre重組酶在2.4 kb的Prrx1啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)，基本上標(biāo)記了后期所有肢體間充質(zhì)細(xì)胞（包括軟骨細(xì)胞、軟骨膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞），但不標(biāo)記肌肉細(xì)胞[28]。Sox9基因在間充質(zhì)細(xì)胞聚集期表達(dá)，并刺激Ⅱ型膠原（collagen 2，Col2）的產(chǎn)生。Sox9-Cre和Col2-Cre都以與Prrx1-Cre類似的方式標(biāo)記幾乎所有的軟骨細(xì)胞、軟骨膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞[29]。

Osx（Sp7）是骨骼形成的重要調(diào)控因子，用成骨特異的Cre敲除Osx基因，會(huì)導(dǎo)致骨骼形成缺陷。在胚胎期標(biāo)記Osx陽(yáng)性細(xì)胞，其子代細(xì)胞可以在新生期階段分化為骨細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞，但隨著機(jī)體的成長(zhǎng)，這群細(xì)胞最終消失，不能繼續(xù)形成骨骼系統(tǒng)[32]。

5.2 新生兒階段的骨骼干細(xì)胞鑒定

與胚胎期時(shí)標(biāo)記的Osx陽(yáng)性細(xì)胞不同，在小鼠出生后第5 d標(biāo)記的Osx陽(yáng)性細(xì)胞可以在小鼠一生中持續(xù)分化為骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞以及骨髓脂肪細(xì)胞。這說明，在機(jī)體內(nèi)Osx基因呈現(xiàn)多次高表達(dá)，而每次表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞種類并不相同。

Gremlin 1（Grem1）是一種BMP拮抗劑，在血管周圍的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[33]。使用Grem1-CreERt進(jìn)行的譜系追蹤實(shí)驗(yàn)表明，這些細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和網(wǎng)狀基質(zhì)細(xì)胞，但不能分化為骨髓脂肪細(xì)胞，因此被命名為“骨-軟骨-網(wǎng)狀細(xì)胞共同的干細(xì)胞（osteo-chondro-reticular，OCR）”[34]。Sox9-CreERt2、Col2-Cre-ERt2以及Aggrecan-CreERt2陽(yáng)性細(xì)胞在新生兒期被標(biāo)記后，與Osx陽(yáng)性細(xì)胞具有相似的分化能力[35]。但值得注意的是，傳統(tǒng)意義上軟骨細(xì)胞的特異標(biāo)志基因Sox9、Col2以及Aggrecan所標(biāo)記的干細(xì)胞具有成骨向分化能力，在一定程度上揭示了干細(xì)胞的來源不僅僅局限在骨髓腔內(nèi)。

5.3 機(jī)體成年階段的骨骼干細(xì)胞鑒定

在成年期Nestin-CreERt2轉(zhuǎn)基因小鼠，可以標(biāo)記到一類隨后可分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的骨骼干細(xì)胞；此外，還可以標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，這一特性不利于后期實(shí)驗(yàn)中對(duì)于特定表型的分析與解釋。

LepR由動(dòng)脈竇血管和小動(dòng)脈周圍的骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。使用LepR-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因體內(nèi)追蹤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明這些LepR陽(yáng)性細(xì)胞可以分化為成年小鼠（尤其是年齡大于2個(gè)月的成年小鼠）骨骼中的大部分具有克隆形成能力的細(xì)胞，其中包括成骨細(xì)胞和骨髓脂肪細(xì)胞等[36]。與胚胎期相似，成年小鼠中的Gli1-CreERt2陽(yáng)性細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及LepR陽(yáng)性的間充質(zhì)細(xì)胞[30]。但是，成年期Osx陽(yáng)性細(xì)胞的成骨向分化能力有限[32]。

小鼠骨髓Mx-1陽(yáng)性細(xì)胞具有體外多向分化能力，但是在體內(nèi)的分化潛力有限，僅標(biāo)記了不到5%的骨髓脂肪細(xì)胞。同樣的，在骨折損傷修復(fù)過程中，新形成的軟骨組織中并未檢測(cè)到Mx-1陽(yáng)性細(xì)胞。這些結(jié)果證明，Mx-1陽(yáng)性細(xì)胞是具有有限分化能力的前體細(xì)胞，能夠在體外持續(xù)分化為成骨細(xì)胞，但無法滿足骨骼干細(xì)胞的全部特性[37]。

5.4 其他部位骨骼干細(xì)胞鑒定

除骨髓腔之外，外骨膜、軟骨膜以及生長(zhǎng)板處也存在骨骼干細(xì)胞。軟骨膜處骨骼干細(xì)胞同樣具備CFU-F特性，有克隆形成能力，同時(shí)具有高度的再生能力。體內(nèi)譜系追蹤實(shí)驗(yàn)[38-39]表明，以Prrx1-CreERt和αSMA-CreERt標(biāo)記的軟骨膜細(xì)胞可以參與骨折損傷后的修復(fù)，并快速生成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。顱面骨的骨縫與軟骨膜有些相似，被認(rèn)為是適合骨骼干細(xì)胞存在的微環(huán)境。譜系追蹤實(shí)驗(yàn)[40-41]表明，以Gli1-CreERt2和Prrx1-CreERt標(biāo)記的骨縫間充質(zhì)細(xì)胞、切牙干細(xì)胞等可以促進(jìn)硬組織的正常更新和再生。Greenblatt團(tuán)隊(duì)新近研究[42]證實(shí)，大量骨骼干細(xì)胞（Cathepsin K陽(yáng)性細(xì)胞）存在于外骨膜處，不僅可形成成骨細(xì)胞，而且在骨折后對(duì)愈傷組織的形成起重要作用，但這群細(xì)胞并不支持造血功能。在生長(zhǎng)板頂部存在著一群緩慢分裂的細(xì)胞，通常被稱為靜止區(qū)細(xì)胞，其高表達(dá)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormone-related peptide，PTHrP）。有研究者[43]推測(cè)靜息區(qū)存在干細(xì)胞，可以形成增殖的軟骨細(xì)胞克隆，并平行于長(zhǎng)骨形成方向分泌促分化的細(xì)胞因子，這部分假設(shè)由在兔體內(nèi)進(jìn)行的自體移植組織實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。最近，研究者[44]使用PTHrP-CreERt2譜系追蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，PTHrP陽(yáng)性軟骨細(xì)胞長(zhǎng)期持續(xù)形成柱狀軟骨細(xì)胞，經(jīng)歷肥大過程并成為生長(zhǎng)板下方的成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞。

6 總結(jié)

骨骼干細(xì)胞成骨向分化是機(jī)體骨骼-牙齒等硬組織形成的關(guān)鍵步驟。在生命進(jìn)程的早期，發(fā)育相對(duì)活躍；而在成年期，骨骼必須保持多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)以應(yīng)對(duì)機(jī)體變化，從骨小梁的快速更迭到骨皮質(zhì)的緩慢重建，并在出現(xiàn)裂縫或骨折時(shí)進(jìn)行硬組織修復(fù)。因此，在胚胎期的骨髓和軟骨膜、新生期的生長(zhǎng)板靜止區(qū)、成年期的骨髓腔和骨膜中都存在多種局部的骨骼干細(xì)胞，這些骨骼干細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)和功能，受局部因素和激素的調(diào)節(jié)。

本文淺談了利用目前已知的干細(xì)胞表面標(biāo)志分子和體內(nèi)譜系追蹤等方法來鑒定骨骼干細(xì)胞的科研進(jìn)展。盡管越來越多的研究者關(guān)注這一領(lǐng)域，但對(duì)于不同骨骼干細(xì)胞之間的關(guān)系仍了解甚少。值得注意的是，目前了解的骨骼干細(xì)胞主要是通過表達(dá)一種特異基因的啟動(dòng)子的方式來鑒定的，在體內(nèi)鑒定出的大多數(shù)干細(xì)胞群異質(zhì)性非常大。 因此，今后需要尋找更為準(zhǔn)確的在體內(nèi)鑒定骨骼干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方式，并有效地與已闡明的骨骼干細(xì)胞標(biāo)志物相結(jié)合，可以為硬組織再生醫(yī)學(xué)以及損傷修復(fù)的組織工程應(yīng)用帶來巨大的幫助。