董 嵩， 劉培敏， 杜向陽(yáng)， 李鳳巖， 曹 營(yíng)， 林大勇， 白 劍

((1. 朝陽(yáng)市第二醫(yī)院， 遼寧 朝陽(yáng)， 122000； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)， 沈陽(yáng) 110847)

骨肉瘤是青少年多發(fā)的骨科惡性腫瘤之一，其容易發(fā)生早期的轉(zhuǎn)移，病情進(jìn)展迅速，愈后不良[1]。由于骨肉瘤增長(zhǎng)迅速，因此需要對(duì)骨肉瘤進(jìn)行有效的以化療為主，在條件成熟后進(jìn)行手術(shù)切除。但是化療有著極大的副作用，臨床急切需要尋找一種副作用低、容易獲取、療效好的新型藥物用于骨肉瘤的輔助治療。

核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)蛋白是一個(gè)表達(dá)于多種細(xì)胞中的多效性轉(zhuǎn)錄因子家族，正常情況下NF-κB處于非活化的狀態(tài)，但在炎癥、腫瘤和免疫功能改變的情況下NF-κB基因發(fā)生活化并導(dǎo)致其所編碼的蛋白明顯升高。有研究表明，骨肉瘤的增殖與NF-κB蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程中NF-κB蛋白也起到促進(jìn)作用[2]。甘草具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效。甘草酸是發(fā)揮其藥理活性的重要有效成分之一，甘草酸進(jìn)入體內(nèi)后可以水解為甘草次酸和甘草黃酮等活性成分，其中甘草次酸具有的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的藥理學(xué)作用[3]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，觀察甘草次酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖的抑制作用，并分析可能的機(jī)制，

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

甘草次酸購(gòu)買(mǎi)于梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(產(chǎn)品標(biāo)號(hào)：S0988，HPLC ≥98%)；甘草次酸和甲基四氮唑藍(lán)(TOX1-1KT)和白藜蘆醇(R5010)購(gòu)買(mǎi)于SIGMA-ALDRICH中國(guó)有限公司；骨肉瘤細(xì)胞MG63購(gòu)買(mǎi)于北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Gene公司；胰酶和Hyclone小牛血清購(gòu)買(mǎi)美國(guó)Thermo scientific公司；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)BD公司；NF-κB抗體買(mǎi)于美國(guó)Santa Cruze生物技術(shù)公司；測(cè)其余分析純?cè)噭┵?gòu)買(mǎi)于國(guó)藥集團(tuán)北京分公司。低速離心機(jī)購(gòu)(型號(hào)：H1650)買(mǎi)于湖南湘儀儀器裝備有限公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：FACSCalibur)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)BD公司；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：Form 311)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：SpectraMax 190)和垂直系列電泳槽(型號(hào)：165-8001)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)與處理方法[4]

本實(shí)驗(yàn)采用骨肉瘤MG63細(xì)胞做為研究對(duì)象，共分5組?？瞻捉M、甘草次酸組(50 μmol/L， 100 μmol/L，200 μmol/L)、陽(yáng)性對(duì)照組。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期后使用 0.1%的胰酶消化并按1×106cells/ml的密度接種于96孔板中進(jìn)行MTT試驗(yàn)。將骨肉瘤細(xì)胞MG63用PBS沖洗2次后，加入 1.25%的胰酶消化3 min后，加入含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞按照1×106cells/ml的密度接種于96孔板中進(jìn)行MTT試驗(yàn)。將MG63細(xì)胞按照1×108cells/ml的密度接種于6孔板中進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，待細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，直至細(xì)胞的融合度接近90%。棄去上清，6孔板中加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組中加入白藜蘆醇40 μmol/L，實(shí)驗(yàn)組中加入濃度分別為50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L的甘草次酸，空白組為不含有甘草次酸的DMEM培養(yǎng)基，在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h和48 h。

1.3 MTT方法檢測(cè)各組細(xì)胞的增值率

將接種于96孔板的用于MTT試驗(yàn)的MG63細(xì)胞取出，棄去上清液，用PBS沖洗2次，在每個(gè)孔中加入50 μl的含有MTT濃度為5 g/L的PBS溶液，在室溫靜置4 h，棄去上清液，每孔中加入DMSO 150 μl，在混勻儀上振動(dòng)混勻30 min，使用550全自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm下檢測(cè)光密度(OD)度值。計(jì)算細(xì)胞增值率(%)=各孔OD值/對(duì)照組OD值均數(shù)×100%。

1.4 Annexin V / PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞MG63的凋亡

將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)各組骨肉瘤細(xì)胞MG63消化后 1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，PBS清洗2次，加入500 μl的Binding buffer重懸細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為1×106cells/ml，取200 μl細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC流式抗體5 μl混勻，再加入5 μl Propidium Iodide，混勻，避光室溫孵育20 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的比例。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)檢NF-kB蛋白的表達(dá)

使用蛋白裂解液將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h的各組骨肉瘤細(xì)胞MG63裂解，將裂解產(chǎn)物收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min后通過(guò)高速離心機(jī)12 000 r/min離心1 min。BCA法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，向SDS-PAGE凝膠中加入樣本，電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入NF-κB (1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體，4℃孵育過(guò)夜后，加入二抗再37℃孵育30 min。通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)，并通過(guò)各條帶的吸光度值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果采用各組中NF-κB灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 甘草次酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63 增殖率的影響

采用MTT的方法計(jì)算細(xì)胞的增值率，在不同濃度的甘草次酸中孵育24 h后，骨肉瘤細(xì)胞MG63增值率與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)；在不同濃度的甘草次酸中孵育48 h后，骨肉瘤細(xì)胞MG63增值率與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05，表1)。甘草次酸200 μmol/L組其骨肉瘤細(xì)胞MG63的增值率最低，與陽(yáng)性對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。

Tab. 1 Comparison of the proliferation rate of cells in each group after incubation with different concentrations ofglycyrrhetinic acid for 24h and 48h(%, n=6)

2.2 甘草次酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在經(jīng)過(guò)甘草次酸孵育24 h后，在50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中凋亡細(xì)胞比例與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)；結(jié)果顯示在經(jīng)過(guò)甘草次酸孵育48 h后，在50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比有顯著性差異 (P<0.05，表2)。

Tab. 2 The proportion of apoptosis of osteosarcoma cells MG63 detecting byAnnexin V / PI double labeling flow cytometry ( %, n=6)

2.3 甘草次酸對(duì)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63的NF-κB蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白印跡的方法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示甘草次酸孵育24 h和48 h后，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中的NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為與空白對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05，表3)

Tab. 3 Relative expression levels of NF-κB protein in each group after incubation with different concentrations ofglycyrrhetinic acid for 48 h n=6)

3 討論

骨肉瘤是一種惡性程度較高，容易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，且對(duì)化療的反應(yīng)較差。甘草是一種具有補(bǔ)益功能的中草藥。在神農(nóng)《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載“甘草，主五臟六腑寒邪氣，堅(jiān)筋骨，長(zhǎng)肌肉，倍氣力，金瘡腫，解毒?！备什葜匾钚猿煞种桓什荽嗡幔哂锌寡?、抗病毒、抑菌、抗腎損傷、抗?jié)?、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和肝細(xì)胞保護(hù)作用等藥理學(xué)活性[5]。而近年來(lái)的國(guó)內(nèi)外的諸多研究證明，甘草次酸可以在體外抑制血液腫瘤、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌和食管癌等多種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞的增殖[6-7]。Pirzadeh 等[8]采用流式細(xì)胞術(shù)觀察到甘草次酸能以劑量依賴的方式上調(diào)人白血病細(xì)胞 HL-60表面CD95 和 CD178 的表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡。Sharma等[9]研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸對(duì)乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。李鳳巖等研究表明，甘草次酸可通過(guò)抑制 AKT 蛋白的表達(dá)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞 SW579 凋亡，通過(guò)有效的抑制 AKT 信號(hào)就能夠促進(jìn)腫瘤 細(xì)胞的凋亡，對(duì)于腫瘤的輔助治療有著積極的作用[10]。 目前國(guó)內(nèi)對(duì)甘草次酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的影響的研究尚未見(jiàn)，本文通過(guò)體外培養(yǎng)的方法，研究甘草次數(shù)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63的影響，并探究其可能機(jī)制，為臨床治療骨肉瘤提供新的視野。本研究結(jié)果顯示，在不同濃度的甘草次酸中孵育24 h和48 h后，骨肉瘤細(xì)胞MG63增值率和凋亡率與空白組相比有顯著性差異,均P<0.05，說(shuō)明甘草次酸對(duì)骨肉瘤的增殖具有抑制作用。

NF-κB是多效性轉(zhuǎn)錄因子家族，表達(dá)于多種細(xì)胞，正常情況下NF-κB處于非活化的狀態(tài)。目前研究表明NF-κB的活化與機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷與應(yīng)激、細(xì)胞的分化和調(diào)亡以及腫瘤生長(zhǎng)呈正相關(guān)，在乳腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、骨腫瘤中均發(fā)現(xiàn)NF-κB表達(dá)明顯升高，如果能有有效抑制NF-κB信號(hào)通路就能夠減緩腫瘤的生長(zhǎng)，為臨床治療提供思路[11]。王玉峰[12]等研究表明NF-κB的抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)能夠誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，其可能機(jī)制為PDTC能抑制NF-κB的信號(hào)通路，下調(diào)Livin和上調(diào)Caspase-9有關(guān)。本研究結(jié)果表明骨肉瘤細(xì)胞MG63經(jīng)過(guò)甘草次酸孵育48 h后，不同濃度組的NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別降低，這表明甘草次酸可能通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通實(shí)現(xiàn)其刺激細(xì)胞凋亡的作用，但是其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，甘草次酸能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖，其可能的影響機(jī)制為NF-κB信號(hào)通路，但是仍需進(jìn)一步的研究和證實(shí)。甘草的來(lái)源廣泛，毒副作用低，價(jià)格低廉，具有較好的臨床應(yīng)用前景。