孫 林， 柏友萍， 林偉其

((安徽師范大學體育學院， 蕪湖 241003)

隨著社會經(jīng)濟的高速發(fā)展，人們的物質(zhì)條件不斷改善，超重、肥胖現(xiàn)象在全世界加速流行[1]。研究發(fā)現(xiàn)，我國老年肥胖人口數(shù)量逐年攀升，直至2014年我國老年人群的超重、肥胖率已經(jīng)達到了41.6%、13.9%[2]。這意味著我國將有越來越多的老年人群面臨肥胖相關疾病的威脅。Vaspin是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，現(xiàn)有的研究認為Vaspin與肥胖、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、糖尿病、高血壓以及心血管疾病有關[3-4]。

運動是一種便捷有效的減肥方式，而甲魚油作為一種補品，其富含微量元素和多不飽和脂肪酸。目前有關運動與甲魚油對Vaspin mRNA表達、蛋白表達、血漿Vaspin濃度、血糖以及IR的影響尚不清楚。基于此，本實驗通過建立老年肥胖SD大鼠實驗動物模型，制定運動與補充甲魚油方案，探討運動與甲魚油對老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織Vaspin水平及IR的影響，為了解老年肥胖及進一步預防肥胖相關疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

本次實驗大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司(合格證號：2007000546402，許可證號：SCXK(滬)2012-0002)，實驗通過了安徽師范大學動物倫理學會同意(20150225)，符合中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。

選取鼠齡3周的雄性SD大鼠(n=50)，清潔級。喂普通飼料至大鼠周齡為55周，普通飼料營養(yǎng)素比例為脂肪 6.0%、蛋白質(zhì)26.4%、碳水化合物67.6%。大鼠在20℃±2℃，相對濕度50%～70%的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。采用體重無差異原則(P>0.05)分為對照組與肥胖建模組，對照組為12只喂普通飼料，肥胖建模組38只喂高脂飼料(高脂飼料營養(yǎng)素比例為脂肪40.0%，蛋白質(zhì)40.0%，碳水化合物20.0%)。建模5周后，符合老年肥胖標準(60周齡，肥胖大鼠體重>120%對照組)為建模成功。隨機選取建模成功的老年肥胖大鼠24只分為4組(n=6)：肥胖模型組(OA)、運動組(OB)、單純補充甲魚油組(OF)、運動結(jié)合甲魚油組(OBF)。在干預過程中OA、OF組各死亡1只大鼠。

1.2 主要試劑

大鼠的Vaspin ELISA試劑盒(美國TSZ 公司生產(chǎn)，上海研域生物科技有限公司代理)。血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Promega，M1705)，R Nase Inhibitor(Sun Shine Bio TM，Trizol(Sun Shine Bio TM，SN114)，Go Taq q PCR Master Mix(Promega，A6002)，R0004)，Oligo d T15(Sun Shine Bio TM)，Random prime(Sun Shine Bio TM)，100 bp DNA Ladder(Sun Shine Bio TM，SN124)；6 × SDS protein Loading buffer(還原型，Sun Shine BioTM，SN336)，PVDF膜(Millipore)，大鼠抗 β-actin 抗體(Boster，BM0627)，羊抗小鼠 Ig G-HRP(H + L)(Sun Shine BioTM，SN135)，羊抗兔 Ig G-HRP(H + L)(Sun Shine Bio TM，SN134)，兔抗Vaspin 抗體(Bioss，bs-6182R)，TBST(含 0.05%Tween20的TBS 緩沖液)，X光膠片(柯達)，Supersignal West Pico Trial kit(Pierce，34079)顯影液、定影液(Sunshinebio，SN340)。

1.3 主要儀器

6跑道大鼠跑臺(Wi32812 /北京)；酶標儀(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板機(Tecan Co-lumbus Washer / 瑞士)；全自動生化分析儀(日立 7060)；PCR儀(MJ research，PTC200)，高速冷凍離心機(力康生科，Neofuge15R)，臺式高速離心機(eppen-dorf，Centrifuge5417)；可見紫外分光光度計(日立，U-2001)，凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達科技，JD801)；電子秤(JM-A20001/中國)。

1.4 運動及補充甲魚油方案

本次運動方案在本實驗室前期的運動方案基礎上進行改良[5]。運動組大鼠進行跑臺適應性練習，3～5次/天，共5 d。運動干預為大鼠運動跑臺的坡度0°，速度為15 m/min，15 min，組間休息5 min，4組/次，1次/天，每次總運動時間為60 min，每周5次，持續(xù)8周。

甲魚油補充方案為OF組直接補充甲魚油，OBF組運動后休息1 h補充甲魚油，0.3～0.4 ml(人體推薦量4.8 g/60 kg的4倍)灌胃，其他組灌胃相等劑量的生理鹽水，1次/天，每周5次，持續(xù)8周。本實驗室甲魚油采用新鮮甲魚做原材料，采用索氏提取法提取，主要成分為微量元素和多不飽和脂肪酸。(本次實驗甲魚油由安徽省生物資源保護和利用重點實驗室聶劉旺教授提供，純度為99.9%)。

1.5 采樣與測試

大鼠經(jīng)過8周干預后停止運動2 d，隨后禁食12 h，禁水6 h。用水合氯醛溶液(10%，3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，成功麻醉后剖腹取腹主動脈血液，分離血漿，取部分血漿測血糖，剩余血漿待測胰島素和Vaspin濃度。采集大鼠腎臟和睪丸周圍內(nèi)臟脂肪組織，取部分含血管少的脂肪立即置于含有Trizol的EP管中，待進一步Vaspin mRNA 表達的測定；另取部分內(nèi)臟脂肪組織包裹于鋁箔紙中，待進一步Vaspin蛋白質(zhì)表達的測定。計算胰島素抵抗[IR =(G0×I0)/22.5，I0為空腹血漿胰島素含量(mU/L)，G0為空腹血糖濃度(mmol /L)]。所有待測樣本均保存于-80℃冰箱。

1.6 qRT-PCR測定內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA表達

Vaspin的引物：上游5'-ACTGTGGCGGGAATTGCTCTAA-3'，下游3'-CACAGAC- ACAGGCACTGATGA-5'；β-actin的引物：上游5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游5'-GCGGCAGTGGCCATCTC-3'。

用Trizol在脂肪組織中提取總RNA，以總DNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增：95℃反應條件下預變性2 min→變性10 s，60℃的反應條件下退火60 s→延伸60 s，擴增40次循環(huán)；熔解曲線：60℃→95℃，每5 s升溫0.3℃，Vaspin Tm值為79.5℃。以上實驗得出數(shù)據(jù)，閾值與Ct值由軟件自動得出，△Ct = Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，采用2-△△Ct法來進行相對定量。得出Vaspin qRT-PCR數(shù)值均擴大1 000倍。

1.7 Western blot測定內(nèi)臟脂肪組織Vaspin蛋白表達

使用SDS-PAGE凝膠電泳進行轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的Vaspin蛋白質(zhì)移至PVDF 膜上。室溫下使用TBS將膜浸濕后移至封閉液中，脫色搖床上搖動封閉1 h；用封閉液將內(nèi)參一抗(1∶1 000)、兔抗(1∶500)、4℃孵育過夜，用TBST室溫下脫色搖床上清洗4次稀釋，使用同樣的方法準備二抗稀釋液(1∶2 000)并與膜接觸，室溫下孵育1 h后，脫色搖床上用TBST清洗5次。進行化學發(fā)光反應，掃描膠片，用Image J2和凝膠圖象處理系統(tǒng)軟件分析目的條帶的凈吸光度值。

1.8 ELISA測定各組血漿Vaspin濃度

通過ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)的雙抗體夾心法，測定血液樣本中Vaspin及胰島素濃度。制作Excel表格，橫坐標為標準品濃度，縱坐標為對應OD值，繪制標準品線性回歸曲線。Vaspin標準品試劑測量值與實際測量值相關系數(shù)r=0.997，曲線方程為y = 0.017x-0.035；胰島素標準品試劑測量值與實際測量值相關系數(shù)r=0.999，曲線方程為y = 0.020x+0.008，曲線方程代入Excel表中，得到的相應濃度值乘以5則為樣本實際濃度。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 運動、甲魚油及運動+甲魚油對老年肥胖大鼠IR的變化影響

與OA相比，8周干預后，OB、OF和OBF血漿胰島素水平下降，但各組間均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；OB、OF和OBF血糖水平明顯降低(P<0.05)；OB、OF和OBF 的IR明顯降低(P<0.01)。與OBF相比，8周干預后，OB和OF的血漿胰島素、血糖和IR在各組之間均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

Tab. 1 The levels of insulin, blood sugar and insulin resistance in rats after exercise

2.2 運動、甲魚油及運動+甲魚油對內(nèi)臟脂肪組織Vaspin的mRNA表達、蛋白表達以及血漿濃度的影響

與OA相比，8周干預后，OB、OF和OBF的內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA表達明顯降低(P<0.01)；OB、OF和OBF的內(nèi)臟脂肪組織Vaspin蛋白質(zhì)表達明顯降低(P<0.01)；OB、OBF的血漿Vaspin濃度明顯降低(P<0.05，P<0.01)，OF的血漿Vaspin濃度下降，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與OBF相比，8周干預后，OB和OF 的內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA表達、蛋白質(zhì)表達和血漿濃度在各組之間均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2，圖1)

Tab. 2 Vaspin mRNA and protein expressions in visceral adipose tissue，and plasma vaspin concentration

Fig. 1 Vaspin protein expression in visceral adipose tissue

3 討論

脂肪因子Vaspin是由Hida等[3]發(fā)現(xiàn)于OLETF大鼠的內(nèi)臟脂肪組織中，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。Kloting等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖個體的內(nèi)臟脂肪中Vaspin mRNA表達量明顯高于正常體重者，且Vaspin在超重和肥胖者的內(nèi)臟脂肪組織中的蛋白表達明顯高于皮下組織，說明Vaspin與肥胖密切相關且在內(nèi)臟脂肪組織中表達更明顯。吳光秀等[7]通過高脂飼料誘導肥胖及IR的大鼠16周后，大鼠的血漿Vaspin水平以及肝臟組織Vaspin mRNA、蛋白質(zhì)表達均明顯提升，通過進一步慢性持續(xù)輸注外源性Vaspin，大鼠體內(nèi)高糖狀態(tài)得到了改善。動物實驗發(fā)現(xiàn)[8]，高脂飲食誘導的SD幼鼠脂肪組織Vaspin濃度高于正常飲食SD幼鼠，通過對SD幼鼠脂肪組織Vaspin及各項指標進行相關分析發(fā)現(xiàn)，Vaspin與SD幼鼠的腰圍、內(nèi)臟脂肪重量呈正相關。本實驗研究表明老年肥胖大鼠體內(nèi)IR和Vaspin表達均明顯高于其他干預組，Vaspin作為脂肪因子與肥胖及IR的關系密切。

研究顯示IR的發(fā)生與胰島素受體信號傳播異常有關，其中PI3K途徑是改善IR調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要途徑[9]。Vaspin作為新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，其對IR的影響途徑成為近些年的研究熱點。劉萍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在地塞米松誘導的IR模型中，信號通路IRS-1/PI3K/PAKT明顯被地塞米松抑制，在使用Vaspin干預后，抑制效果明顯減弱。另一項實驗發(fā)現(xiàn)Vaspin可以通過IRS-2/PI3K/AKT-B/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路和NF-kB炎癥通路，促進棕櫚酸誘導的胰島素β細胞分泌[11]。Liu等[12]通過對IR動物模型體內(nèi)IRS/PI3K/AKt/GLUT信號蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)Vaspin能降低肝臟、骨骼肌和脂肪中p-IRS-1(p-IRS-2)與IRS-1(IRS-2)的比值，增加p-AKt與AKt的比值，促進GLUT4在骨骼肌和脂肪組織上的膜位移。除此之外，該研究還發(fā)現(xiàn)Vaspin可抑制NF-kB通路成分及下游炎癥因子的表達，減輕體內(nèi)炎癥狀態(tài)。推測Vaspin可通過作用于PI3K途徑和炎癥通路來改善動物模型體內(nèi)的IR。在本次實驗中老年肥胖大鼠體內(nèi)均有高IR和Vaspin的高表達，這可能是大鼠的機體應對體內(nèi)炎癥和高IR的一種機制，通過應激性的增高Vaspin的表達來改善體內(nèi)的代謝紊亂。

運動可提高骨骼肌GLUT4表達，進而促進骨骼肌等相關組織對糖的利用[13]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)有氧運動能夠增加抗炎因子脂聯(lián)素的表達[14]，降低炎癥因子的應答能力，改善老年肥胖大鼠的糖脂代謝、胰島素敏感性、血糖水平[15-16]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，通過不同運動強度干預老年肥胖大鼠，中低強度均可明顯降低大鼠內(nèi)臟脂肪組織Vaspin mRNA、蛋白表達[17]。甲魚油作為可食用油脂，研究認為魚油中富含的多不飽和脂肪酸有利于保持葡萄糖的正常代謝，增加肝臟對葡萄糖的攝取[18]。目前有關甲魚油與Vaspin的研究較少，兩者之間的關系尚不清楚。本次實驗通過運動、甲魚油以及運動+甲魚油干預老年肥胖大鼠，發(fā)現(xiàn)干預后三組老年肥胖大鼠的Vaspin表達、血糖水平均有了明顯下降，IR得到改善?？紤]到老年肥胖大鼠體內(nèi)的高Vaspin表達可能是為了抵抗體內(nèi)的代謝紊亂的一種應激機制，推測干預后的老年肥胖大鼠體內(nèi)IR得到了改善，代謝紊亂恢復正常，因此Vaspin的表達也隨之降低。在本次實驗中，我們使用了三種干預方式，但干預后各組之間的老年肥胖大鼠的Vaspin表達、血漿Vaspin濃度、胰島素及血糖的結(jié)果均沒有顯著差異，對IR的改善效果也沒有差異。結(jié)果說明這三種干預方式的效果一致，運動+甲魚油沒有比運動或者甲魚油表現(xiàn)出更好的效果，說明這兩者之間沒有很好的協(xié)同作用。在本次實驗中，運動和甲魚油干預都取得了相同的效果，推測這兩種干預對老年肥胖大鼠的影響有上限，在達到上限后效果減弱，所以運動+甲魚油才沒有取得更好的效果。目前有關運動+甲魚油的相關研究較少，有待進一步研究。

總而言之，老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織中Vaspin的高表達可能是對體內(nèi)IR的應激反應。運動、補充甲魚油以及運動結(jié)合甲魚油在改善IR的同時，Vaspin的表達也會隨之降低，推測Vaspin的高表達可視為IR的危險信號。運動、甲魚油、運動+甲魚油均能改善老年肥胖大鼠的IR，但尚未發(fā)現(xiàn)二者之間有較好的協(xié)同作用。

(衷心感謝安徽省生物資源保護和利用重點實驗室聶劉旺教授與夏興權(quán)教授為本次實驗提供幫助。)