林道朋， 陳 莎， 陸溧玲， 王 玉， 呂芳芳， 施林微， 孔曉霞， 單小鷗， 張海鄰△

((1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院， 浙江 溫州 325035； 2. 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院病理科)， 湖北 黃石 435000； 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院低氧研究所， 浙江 溫州 325035)

血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管壁內(nèi)側(cè)，形成半選擇性的通透屏障，調(diào)節(jié)血漿蛋白、溶質(zhì)、液體和炎癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的內(nèi)皮屏障破壞，內(nèi)皮通透性增加是許多急慢性炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制中必不可少的組成成分，包括急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化[2, 3]等。因此保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、維持細(xì)胞屏障在屏障功能受損相關(guān)疾病中具有重要的作用。

Apelin-13是一種新近發(fā)現(xiàn)的生物活性肽，是G蛋白耦聯(lián)受體-血管緊張素受體AT-1相關(guān)蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin recetor AT-1, APJ)的內(nèi)源性配體[4]。Apelin-13 具有抗炎[5]、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[6]、改善肺動(dòng)脈高壓[7, 8]等功能。同時(shí)有報(bào)道指出，Apelin-13能調(diào)節(jié)血管再生[9]以及保護(hù)血腦屏障[10]。然而，Apelin-13保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障的具體機(jī)制還尚未闡明。因此，本研究應(yīng)用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通過給予脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)復(fù)制內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能受損模型，觀察Apelin-13對(duì)其保護(hù)及其具體機(jī)制，為內(nèi)皮屏障功能受損及血管炎癥相關(guān)疾病的防治提供新的思路和潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Endothelial Cell Medium(ECM)培養(yǎng)基購自ScienCell公司；LPS和Apelin-13購自美國Sigma公司；VE-cadherin抗體、NF-κBp65抗體、F-actin抗體及GAPDH抗體購自Abcam公司；BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK8試劑盒購自日本DOJINDO公司。

1.2 HUVECs培養(yǎng)

配制完全培養(yǎng)基(5%的胎牛血清，1%生長因子，1%青霉素、鏈霉素雙抗，93%基礎(chǔ)ECM培養(yǎng)基)。HUVECs細(xì)胞在37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待90%融合狀態(tài)傳代及后續(xù)細(xì)胞活力、細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備

細(xì)胞隨機(jī)分成Control組、LPS組、Apelin-13+LPS組、Apelin-13組。LPS溶于無菌生理鹽水，應(yīng)用培養(yǎng)基稀釋濃度為5 μg/ml，時(shí)間作用24 h，復(fù)制屏障功能受損模型。Apelin-13溶于無菌生理鹽水，經(jīng)培養(yǎng)基稀釋，濃度為1 μmol/L。Apelin-13提前30 min給予，再給予LPS作用24 h，確定Apelin的保護(hù)作用。

1.4 CCK8檢測細(xì)胞活力

選擇對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，以1×104cells/well的密度鋪于96孔板中(5復(fù)孔)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，予以LPS(0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml)及Apelin-13(0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L)處理24 h，進(jìn)行藥物濃度篩選。給藥結(jié)束后用無菌PBS洗滌孔板2～3次，傾去多余液體，每孔板中加入100 μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再加入10 μl CCK8溶液，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2～4 h。多功能酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定各組OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)

無菌4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞三次，每次5 min。RIPA蛋白裂解液(RIPA緩沖液與蛋白酶抑制劑PMSF按100∶1比例配制)，以100 μl/well加入6孔板中。用蛋白刮刀刮取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，收集于EP管中，12 000 r/min，4℃，10 min離心，吸取上清，棄沉淀。BCA試劑盒測定蛋白濃度。各管加入4×Loading Buffer，置于100℃，水浴10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST洗滌3次，每次5 min。分別加入特異性抗VE-cadherin、抗F-actin抗體及抗內(nèi)參GAPDH抗體，4℃過夜。次日，TBST洗滌3次，每次5 min。加入髓過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。曝光液按照A液∶B液=1∶1配制，均勻滴在膜上，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。應(yīng)用Image J圖像處理軟件分析相應(yīng)條帶灰度值，計(jì)算各組目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 免疫熒光檢測蛋白表達(dá)

在6孔板內(nèi)放入無菌清潔蓋玻片，接種1×105cells/well，貼壁后給予藥物處理。PBS洗三次，每次5 min。滴加4%多聚甲醛，于冰上固定40 min。棄去多聚甲醛，在空氣中完全干燥，PBS洗3次，每次2 min。固定蓋玻片四角，0.1%Triton打孔20 min，PBS洗3次，每次2 min。用于封閉的5%BSA滴加于載玻片上，靜置30 min。1%BSA配制的一抗4℃孵育過夜。室溫下復(fù)溫30 min，PBS洗3次，每次2 min。1%BSA配制的二抗室溫避光孵育2 h，PBS洗3次，每次2 min。DAPI避光染細(xì)胞核5 min，PBS洗3次，每次5 min?？篃晒忖鐒┓馄?，熒光顯微鏡拍片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Apelin-13對(duì)LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

CCK8檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，不同濃度(1、5、10 μg/ml)LPS作用于細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而LPS在濃度0.01和0.1 μg/ml對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)選擇5 μg/ml LPS做后續(xù)實(shí)驗(yàn)(表1)。而與LPS組相比，不同濃度(0.1 μmol/L、0.5 μmol/L和1 μmol/L)Apelin-13對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低均具有改善作用(P<0.01)，本實(shí)驗(yàn)選擇效果最顯著的藥物濃度為1 μmol/L Apelin-13做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)使用Apelin-13，不同濃度Apelin-13對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響(表2)。

Tab. 1 Cell viability in different concentrations of LPS for 24 h(OD, n=4)

Tab. 2 Effects of Apelin-13 on viability of HUVECs induced by LPS(OD, n=4)

2.2 Apelin-13對(duì)LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損傷相關(guān)蛋白影響

Western blot檢測各組VE-cadherin、F-actin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，LPS組的黏附連接蛋白VE-cadherin的表達(dá)量下降(P<0.01)，構(gòu)成應(yīng)力纖維的F-actin表達(dá)量上升(P<0.05)，而Apelin-13干預(yù)后，顯著改善LPS誘導(dǎo)的蛋白VE-cadherin(P<0.05)和F-actin(P<0.01)的表達(dá)改變(圖1，表3)。

Fig. 1 Protein expressions of VE-cadherin and F-actin measured by Western blot

Tab. 3 Relative expression levels of VE-cadherin and F-actin in HUVECs n=3)

2.3 Apelin-13對(duì)LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光檢測結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞膜表面VE-cadherin表達(dá)減少，細(xì)胞間連接連續(xù)性中斷，且F-actin聚集增多，應(yīng)力纖維形成增加(箭頭)，排列紊亂，細(xì)胞間隙增大(三角形)。與LPS組相比，Apelin-13干預(yù)后，改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞間VE-cadherin連續(xù)性受損(箭頭)，減輕F-actin聚集，緩解細(xì)胞間隙增大。單獨(dú)給予Apelin-13處理，與對(duì)照組無明顯差異(圖2)。

Fig. 2 Protein expressions of F-actin and VE-cadherin were measured by immunofluorescence

2.4 Apelin-13對(duì)LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB入核影響

免疫熒光檢測各組細(xì)胞中NF-κB p65入核情況，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，LPS顯著增加NF-κB p65的入核；而與LPS組相比，給予Apelin-13后，明顯減輕LPS對(duì)NF-κB p65的入核作用；單獨(dú)給予Apelin-13與正常對(duì)照組無明顯差異(圖3)。

Fig. 3 Apelin-13 attenuated the nuclear translocation of NF-κB induced by LPS in HUVECs

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成內(nèi)皮屏障，發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)血管張力，防止炎性細(xì)胞、血細(xì)胞滲出等，是維持組織、器官功能的要素之一[11]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)導(dǎo)致的屏障功能受損是多種疾病病理特點(diǎn)[12,13]。因此，尋找保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及維持其屏障功能的藥物對(duì)疾病的治療具有重要意義。

Apelin是一種新近發(fā)現(xiàn)的生物活性肽，在心、肺、腦、腎等組織均有表達(dá)，主要以Apelin-13和Apelin-36兩種形式存在[4]。有研究表明，Apelin-13在多種疾病中具有保護(hù)作用，可明顯改善油酸及LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷[14, 15]。同時(shí)可通過抑制肺血管平滑肌增殖，改善肺動(dòng)脈高壓[16]。但其對(duì)內(nèi)皮屏障功能的作用及機(jī)制還尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過LPS誘導(dǎo)HUVECs損傷及屏障功能受損，檢測Apelin-13的保護(hù)作用。首先通過CCK8法檢測細(xì)胞生存率，結(jié)果表明，給予Apelin-13干預(yù)明顯減輕細(xì)胞損傷，增加細(xì)胞存活率。在細(xì)胞水平上，Apelin-13對(duì)LPS損傷的HUVECs具有保護(hù)作用。

細(xì)胞間連接中的黏附連接在維持細(xì)胞內(nèi)皮屏障功能起著關(guān)鍵的作用[17]。VE-cadherin胞內(nèi)段特定結(jié)構(gòu)域通過連環(huán)蛋白Catenin與細(xì)胞骨架蛋白F-actin相連，構(gòu)成粘附連接。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，發(fā)生黏附連接結(jié)構(gòu)受損，內(nèi)皮通透性增加[18]。本研究Western blot結(jié)果表明， LPS作用于HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞，VE-cadherin總蛋白表達(dá)量下降，骨架蛋白F-actin的表達(dá)量上調(diào)。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證明，細(xì)胞間VE-cadherin蛋白表達(dá)下降，連接連續(xù)性中斷，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維形成增多，排列紊亂，黏附連接破壞，細(xì)胞間隙變大。Apelin-13明顯改善細(xì)胞間VE-cadherin連續(xù)性中斷及細(xì)胞F-actin骨架的破壞。因此，Apelin-13的屏障保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)VE-cadherin等內(nèi)皮細(xì)胞間連接相關(guān)蛋白有關(guān)。

有研究表明，過度激活的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能受損在急性肺損傷中發(fā)揮著舉足輕重的作用[19]。伽馬射線可以通過MAPK/NF-κB途徑破壞HUVECs細(xì)胞連接，導(dǎo)致VE-cadherin，ZO-1蛋白降低，通透性增加[20]，暗示炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能受損的重要因素之一。本研究通過免疫熒光檢測NF-κB p65入核，結(jié)果顯示，Apelin-13減弱LPS促進(jìn)NF-κB p65入核作用，說明Apelin-13抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。據(jù)此，我們推測Apelin-13對(duì)內(nèi)皮黏附連接的保護(hù)作用可能與抑制NF-κB入核有關(guān)，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，我們推測，在LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷及屏障功能受損中，炎癥反應(yīng)是損傷內(nèi)皮屏障功能的重要因素。應(yīng)用Apelin-13可以改善LPS誘導(dǎo)的HUVECs屏障的損傷，其保護(hù)作用可能與抑制炎癥相關(guān)。這為內(nèi)皮屏障受損相關(guān)疾病的治療和新藥開發(fā)提供新的理論依據(jù)。