張新超，邊艷珠*，國(guó)方娜,2，魏 強(qiáng)，胡玉敬，田叢娜，吳大勇，張文艷

(1.河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050051；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北 邯鄲 056002)

整合素是一種介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與外環(huán)境之間的跨膜受體蛋白，廣泛參與傳遞細(xì)胞信號(hào)和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。整合素受體αⅤβ3是整合素家族的重要成員，在惡性腫瘤細(xì)胞或新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上高表達(dá)，而在正常組織或已存在血管內(nèi)皮細(xì)胞上不表達(dá)或表達(dá)極低[1-5]?；诖松飳W(xué)特性，整合素受體αⅤβ3有望成為診斷和評(píng)估惡性腫瘤的特異性分子靶點(diǎn)[5]。聯(lián)肼尼克酰胺-3聚乙二醇-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環(huán)肽二聚體(3 polyethylene-glycol Arg-Gly-Asp dimer, 3PRGD2)是一類(lèi)多肽類(lèi)衍生物，對(duì)腫瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素受體αⅤβ3具有高度親和力，對(duì)于診斷腫瘤具有較高特異性。臨床試驗(yàn)[6]已證實(shí)可采用99锝m-3PRGD2(99Tcm-3PRGD2)顯像診斷肺癌和乳腺癌等，而診斷骨轉(zhuǎn)移瘤的相關(guān)報(bào)道[7]較少。本研究通過(guò)99Tcm-3PRGD2SPECT對(duì)大鼠骨移植瘤顯像，探討其診斷骨轉(zhuǎn)移瘤的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取5只健康清潔級(jí)雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量140～160 g，30只健康清潔級(jí)雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量220～250 g，均購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)：SCXK 2016-0002)。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物分組與建模 向5只體質(zhì)量140～160 g雌性Wistar大鼠腹腔內(nèi)接種復(fù)蘇后Walker-256大鼠乳腺癌細(xì)胞(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)用于増殖細(xì)胞，待7～10天大鼠腹部明顯隆起后，抽取大鼠棕黃色濃稠腹腔積液置于無(wú)菌離心管，以1 000 r/min離心 3 min后棄去上清液，加入適量0.9%無(wú)菌生理鹽水，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，并在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×108/ml。將30只體質(zhì)量220～250 g雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=20)和對(duì)照組(n=10)。以10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，于左后肢脛骨距脛股關(guān)節(jié)面1.5 cm處鉆取約1 mm2小孔，采用微量注射器于骨髓腔內(nèi)分別注入5 μl活性腹腔積液混懸液(實(shí)驗(yàn)組，約5.0×105個(gè)腫瘤細(xì)胞)[8-9]及煮沸30 min的滅活腫瘤細(xì)胞(對(duì)照組)。于此后第10、20及30天行大鼠脛骨CT掃描，參數(shù)：管電壓120 kV，管電流100 mA，矩陣512×512，重建層厚0.625 mm，判斷轉(zhuǎn)移瘤模型是否建立成功；成瘤標(biāo)準(zhǔn)[10]：CT示骨髓腔內(nèi)密度減低區(qū)及骨皮質(zhì)斷裂、缺損。

1.3 制備99Tcm-3PRGD2和大鼠SPECT顯像 依據(jù)文獻(xiàn)[11-12]方法制備99Tcm-3PRGD2，并檢測(cè)其放射化學(xué)純度：將新鮮Na99TcmO4淋洗液濃度調(diào)整至 37 MBq/0.1 ml后注入3PRGD2凍干品中，充分震蕩搖勻；取99Tcm-3PRGD2與大鼠血清混合于煮沸消毒的安培瓶，并置于37℃水浴鍋內(nèi)，以Waltman濾紙為固定相、丙酮為展開(kāi)劑，以薄層紙層析法測(cè)定混合液1 h、2 h、4 h和6 h的放射化學(xué)純度。采用GE Discovery 670 SPECT/CT儀，探頭與大鼠距離約5 cm，能峰 140 keV,窗寬±20%，矩陣128×128，放大倍數(shù)1.0，采集時(shí)間10 min。建模后第30天經(jīng)鼠尾靜脈注射0.2 ml99Tcm-3PRGD2(74 MBq)，1 h后行SPECT靜態(tài)平面顯像[11]。

1.4 圖像分析 采用GE Xeleris后處理軟件分析圖像，由2名具有10年以上骨腫瘤核醫(yī)學(xué)診斷經(jīng)驗(yàn)的副主任醫(yī)師聯(lián)合閱片，并利用ROI技術(shù)計(jì)算骨移植瘤部位放射性計(jì)數(shù)與對(duì)側(cè)相應(yīng)部位同等大小區(qū)域的放射性計(jì)數(shù)比值(target to nontarget ratios, T/NT)，ROI約20 mm2，每只大鼠重復(fù)測(cè)量5次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.5 病理學(xué)檢查 顯像結(jié)束后斷頸處死大鼠，截取左脛骨中上段組織，經(jīng)沖洗、固定后置于脫鈣液中脫鈣至少60天[13]，再經(jīng)梯度乙醇、二甲苯脫水、包埋、切片、干燥后行HE染色，經(jīng)脫蠟、乙醇梯度水化后行免疫組織化學(xué)染色。由2名具有10年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理科副主任醫(yī)師在不知曉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的情況下聯(lián)合閱片，分別觀(guān)察骨移植瘤及骨組織受侵情況和細(xì)胞胞膜、胞漿及血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色即為整合素αⅤβ3受體陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。符合正態(tài)性分布和方差齊性，以t檢驗(yàn)比較2組T/NT。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立大鼠乳腺癌骨移植瘤模型 建模后10天內(nèi)實(shí)驗(yàn)組2只大鼠死亡。建模后第10天，左側(cè)脛骨CT于大鼠骨皮質(zhì)和髓腔內(nèi)均未見(jiàn)明顯密度改變；第20天，10只(10/18)大鼠左側(cè)脛骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)密度減低區(qū)；第30天密度減低區(qū)范圍擴(kuò)大，并見(jiàn)骨皮質(zhì)片狀缺損或中斷，部分大鼠出現(xiàn)跛行；剩余8只大鼠始終未出現(xiàn)骨皮質(zhì)或髓腔密度改變。對(duì)照組大鼠活動(dòng)自如，均未出現(xiàn)脛骨周?chē)浗M織腫脹及跛行，建模第30天CT掃描示左脛骨骨皮質(zhì)完整，髓腔內(nèi)密度均勻，未見(jiàn)骨破壞表現(xiàn)。

圖1 2組大鼠左側(cè)脛骨骨移植瘤區(qū)99Tcm-3PRGD2 SPECT顯像(箭示骨移植瘤部位) A.實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)顯像劑濃聚(箭)；B.對(duì)照組未見(jiàn)顯像劑濃聚

圖2 2組大鼠左側(cè)脛骨移植瘤病理圖(×400) A、B.實(shí)驗(yàn)組HE染色見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)(A)，對(duì)照組見(jiàn)大量橢圓形排列規(guī)則的骨細(xì)胞、未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞(B)；C、D.實(shí)驗(yàn)組αⅤβ3免疫組織化學(xué)染色示大量棕黃色的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞(C)，對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞(D)

2.299Tcm-3PRGD2放射化學(xué)純度及SPECT顯像 標(biāo)記后的99Tcm-3PRGD2為無(wú)色澄清溶液，與血清混合溫育1 h、2 h、4 h和6 h后，放射化學(xué)純度分別為97.60%、97.20%、96.10%和95.40%。實(shí)驗(yàn)組10只建模成功，SPECT顯像示左側(cè)脛骨骨移植瘤區(qū)顯像劑濃聚(圖1A)，平均T/NT為(3.48±0.44)；對(duì)照組大鼠左側(cè)脛骨未見(jiàn)顯像劑濃聚或少量顯像劑增濃(圖1B)，平均T/NT為(1.10±0.84)；實(shí)驗(yàn)組T/NT比值明顯高于對(duì)照組(t=16.66,P<0.001)。

2.3 病理學(xué)結(jié)果 HE染色示實(shí)驗(yàn)組大鼠脛骨骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)不完整，周?chē)罅磕[瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞中分布不等量紅細(xì)胞，血管、神經(jīng)結(jié)構(gòu)消失，哈弗管擴(kuò)大，骨細(xì)胞腫脹、固縮或消失，部分被破骨細(xì)胞取代，符合腫瘤表現(xiàn)(圖2A)；對(duì)照組大鼠脛骨骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)完整清晰，可見(jiàn)大量排列均勻的哈弗系統(tǒng)，其間見(jiàn)均勻分布的骨陷窩，內(nèi)見(jiàn)橢圓形骨細(xì)胞(圖2B)。實(shí)驗(yàn)組免疫組織化學(xué)染色顯示腫瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞包膜及包漿上整合素αⅤβ3受體染為棕黃色(圖2C)，對(duì)照組未見(jiàn)棕黃色腫瘤細(xì)胞(圖2D)。

3 討論

整合素是一種介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與外環(huán)境如細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)之間的跨膜受體蛋白。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，整合素將ECM的化學(xué)成分與力學(xué)狀態(tài)等有關(guān)信息傳入細(xì)胞，參與傳遞細(xì)胞信息、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[11]。整合素αⅤβ3是整合素家族的重要成員,與腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；在正常組織及正常血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或低表達(dá),而在活動(dòng)期惡性腫瘤細(xì)胞或新生血管內(nèi)皮細(xì)胞呈高表達(dá)。能與整合素αⅤβ3受體特異性相結(jié)合的分子探針可作為SPECT顯像劑，在腫瘤診斷、良惡性鑒別和療效評(píng)估等方面發(fā)揮重要作用[5]。

核素標(biāo)記多肽顯像是早期診斷腫瘤的關(guān)鍵。HAUBNER首次將18F標(biāo)記精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp， RGD)示蹤劑用于整合素αⅤβ3受體顯像[14]。研究[15-16]證實(shí)放射性核素標(biāo)記的RGD多肽可對(duì)肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、腦膠質(zhì)瘤等高表達(dá)整合素αⅤβ3受體的腫瘤顯像，無(wú)創(chuàng)評(píng)估腫瘤組織內(nèi)整合素αⅤβ3受體的表達(dá)水平。通過(guò)檢測(cè)整合素αⅤβ3受體表達(dá)水平可評(píng)估腫瘤良惡性。已有研究[6]報(bào)道采用RGD診斷原發(fā)腫瘤和評(píng)價(jià)療效，但用于骨轉(zhuǎn)移瘤的研究較少。MIAO等[7]發(fā)現(xiàn)99Tcm-3PRGD2診斷骨轉(zhuǎn)移瘤的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率均高于99锝m-亞甲基二膦酸鹽骨顯像(99Tcm-MDP)。99Tcm-3PRGD2顯像具有高特異度，骨折或退行性改變等良性變病少見(jiàn)顯像劑濃聚，故有助于降低假陽(yáng)性率；其診斷溶骨性病變的靈敏度高，單純?nèi)芄切圆∽兛梢?jiàn)顯像劑濃聚；3PRGD2不依賴(lài)于無(wú)機(jī)鹽代謝更新速度和成骨細(xì)胞活躍程度，而與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，病灶中尚未出現(xiàn)成骨反應(yīng)時(shí)，99Tcm-3PRGD2顯像即可見(jiàn)顯像劑濃聚[5]。本研究通過(guò)復(fù)制乳腺癌骨移植瘤大鼠模型模擬惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移，以99Tcm-3PRGD2SPECT進(jìn)行顯像，探討其診斷骨轉(zhuǎn)移瘤的可行性，結(jié)果顯示該方法可行，且99Tcm-3PRGD2標(biāo)記率高，安全性和穩(wěn)定性均佳。

本研究的主要不足：①骨移植瘤模型成瘤率相對(duì)較低；②未與其他影像學(xué)方法進(jìn)行比較，有待進(jìn)一步完善。

綜上所述，99Tcm-3PRGD2易標(biāo)記，放射化學(xué)純度高，穩(wěn)定性好；99Tcm-3PRGD2SPECT顯像可無(wú)創(chuàng)診斷大鼠骨移植瘤，有望為臨床診斷骨轉(zhuǎn)移瘤提供新的影像學(xué)方法。