楊建航 趙修華

（東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040）

在全世界范圍內(nèi)調(diào)查研究報道中，喜樹作為一種特殊的樹種，大量存在于我國南方地區(qū)［1］。喜樹因其具有獨特的活性物質(zhì)而引起人們的廣泛關(guān)注，國內(nèi)外專家學(xué)者先后對喜樹的果實、樹皮、葉等部位進行了大量研究調(diào)查，20世紀(jì)60年代，Wall等［2］率先從喜樹中發(fā)現(xiàn)一種新型生物堿類物質(zhì)，并將其稱為喜樹堿。大量專家學(xué)者進一步研究，先后報道了從喜樹中提取分離得到了數(shù)十種活性物質(zhì)，其中以生物堿類尤為重要。這些化合物呈現(xiàn)出不同的生物活性，其中喜樹堿、羥基喜樹等通過國內(nèi)外專家學(xué)者的研究證實具有抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的獨特作用，因此對癌癥具有獨特的活性［3～4］，作為一種前體藥物，具有相當(dāng)重要的社會價值及醫(yī)療價值。以往人們提取喜樹堿和羥基喜樹堿更多一些是從果實或樹皮中提取，然而喜樹葉中同樣存在這類活性物質(zhì)，喜樹葉具有資源豐富、不傷害喜樹、可持續(xù)性等優(yōu)點。所以本文選擇以喜樹葉為提取原料。

超聲—微波輔助提取法，是一種新的提取方法，相比于傳統(tǒng)提取方法具有顯著優(yōu)勢，所以受到越來越多專家學(xué)者的青睞。該方法能量消耗低、工作效率高、操作簡單，廣泛地應(yīng)用于各種生物活性成分的提取過程［5～9］。超聲波具有極強的穿透力，其產(chǎn)生的瞬間高壓可使植物細胞壁破碎，使植物細胞中的活性物質(zhì)不再受植物細胞壁阻礙而釋放出來，加速了活性物質(zhì)的溶出速率，進而加速了活性物質(zhì)的提取進程。而微波輻射會發(fā)射電磁波，使植物內(nèi)迅速升溫，加速活性物質(zhì)的溶出速率。超聲波與微波相互結(jié)合可以更加高效地提取活性物質(zhì)。

表面活性劑在水相中不同的濃度呈現(xiàn)不同的狀態(tài)，當(dāng)在水溶液中達到一定的濃度時會發(fā)生分子聚集的現(xiàn)象，形成直徑在幾納米左右的膠束，這樣的小液滴顯著增加了其表面積，有利于對水相中的有機物質(zhì)進行富集［10～20］。

本文以資源豐富且具有可持續(xù)性的喜樹葉為原料，用表面活性劑水溶液為提取溶劑，采用超聲—微波輔助技術(shù)作為主要提取方式，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，以總提取率為響應(yīng)指標(biāo)，對提取工藝進行優(yōu)化。利用高效液相作為檢測手段，以期為喜樹堿和羥基喜樹堿的提取提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

Startorious 1721 電子天平（德國賽多利斯公司）；BF0-G-100型高速粉碎機（陜西寶正機械有限公司）；LXJ-ⅡB型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHJ-A4 水浴恒溫磁力攪拌器（常州華奧儀器制造）；Waters 2489 型高效液相色譜儀（美國沃特世）；CW-2000 超聲—微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀（上海新拓分析儀器科技公司）。

1.2 材料

喜樹葉（千草堂中藥材批發(fā)）；喜樹堿（98%，上海源葉生物科技）；羥基喜樹堿（98%，上海源葉生物科技）；十二烷基硫酸鈉（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展）；十二烷基苯磺酸鈉（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造）；椰油酰胺丙基甜菜堿（山東優(yōu)索化工科技）；椰油基葡萄糖苷羥丙基三甲基氯化銨（上海諾頌實業(yè)）；十六烷基三甲基溴化銨（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展）；十二烷基磺酸鈉（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；十二烷基二甲基甜菜堿（山東優(yōu)索化工科技有限公司）；烷基糖苷APG1214（上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 HPLC 法測定喜樹葉中喜樹堿及羥基喜樹堿

（1）HPLC 法檢測喜樹堿及羥基喜樹堿的條件：色譜柱為Diamonsil C18反相柱（5μm，4.6 mm×150 mm）；流動相為色譜級甲醇∶超純水=55∶45（V/V），液相柱溫度為25℃，檢測波長設(shè)定為265 nm，液相流速設(shè)定為1.0 mL·min-1，每次進樣量設(shè)定為

10μL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配置：用電子天平稱取喜樹堿和羥基喜樹堿各10 mg 分別置于容量為10 mL 的容量瓶中，用DMSO 溶液準(zhǔn)確定容至10 mL，在超聲條件下使其充分溶解，用移液槍分別準(zhǔn)確移取喜樹堿和羥基喜樹堿各1 mL 置于容量為10 mL 的容量瓶中，用色譜級甲醇溶液定容至10 mL，在超聲條件下使其溶解均勻。采用對半稀釋法進行稀釋，按照上述色譜條件對各個濃度對照品溶液的峰面積進行測定，其中縱坐標(biāo)為峰面積積分值Y值，橫坐標(biāo)為對照品溶液濃度（μg·mL-1），利用軟件分別繪制喜樹堿和羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并計算回歸方程。

（3）精密度試驗：精密吸取喜樹堿和羥基喜樹堿對照品混合液，按照上述色譜條件，進樣量為10 μL，重復(fù)進樣3 次，測喜樹堿和羥基喜樹堿含量。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值的計算方法如下：

1.4 表面活性劑的篩選

選用陰離子型表面活性劑（十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉）、陽離子型表面活性劑（十六烷基三甲基溴化銨、椰油基葡萄糖苷羥丙基三甲基氯化銨）、兩性離子型表面活性劑（椰油酰胺丙基甜菜堿、十二烷基二甲基甜菜堿）、非離子型表面活性劑（烷基糖苷）作為測試。分別配置1 g·L-1的表面活性劑水溶液，超聲一段時間使其分散均勻，在攪拌下移取5 mL 表面活性劑水溶液，分別加入喜樹堿和羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品使其過飽和，10 000 r·min-1下離心10 min 后取上清，待測液相。每組實驗重復(fù)進行3 次，記錄并計算平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 不同提取方法對提取結(jié)果的影響

精密稱取喜樹葉粉末5.0 g 按1∶40 加入配置濃度為8 g·L-1的表面活性劑水溶液，分別在熱回流提取8 h；超聲提取400 W、50℃、2.5 h；加熱提取70℃、2 h；勻漿提取10 000 r·min-1、3 min；超聲—微波提取500 W、10 min、超聲打開條件下進行提取，提取液10 000 r·min-1離心10 min 取上清，待測液相。每組實驗重復(fù)進行3次，記錄并計算平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 單因素試驗

1.6.1 微波時間對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g 喜樹葉粉末，共計5 份。在液固比1：60（m：V）、微波功率500 W、表面活性劑濃度4 g·L-1、微波時間分別為（4、6、8、10 和12 min）條件下進行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，利用高速離心機以10 000 r·min-1的條件將混合物離心10 min，分離得到上清液，利用液相色譜進行檢測，計算得到喜樹堿和羥基喜樹堿提取量，實驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.6.2 料液比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g 喜樹葉粉末，共計5 份。在微波時間10 min、微波功率500 W、表面活性劑濃度4 g·L-1、料液比分別為（1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80）條件下進行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，利用高速離心機以10 000 r·min-1的條件將混合物離心10 min，分離得到上清液，利用液相色譜進行檢測，計算得到喜樹堿和羥基喜樹堿提取量，實驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.6.3 微波功率對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g 喜樹葉粉末，共計6 份。在液固比1∶60（m∶V）、微波時間10 min、表面活性劑濃度4 g·L-1、微波功率分別為（100、300、500、700、900 和1 000 W）條件下進行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，利用高速離心機以10 000 r·min-1的條件將混合物離心10 min，分離得到上清液，利用液相色譜進行檢測，計算得到喜樹堿和羥基喜樹堿提取量，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6.4 表面活性劑濃度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.0 g 喜樹葉粉末，共計5 份。在液固比1∶60（m∶V）、微波時間10 min、微波功率500 W、表面活性劑濃度分別為（2、4、6、8 和10 g·L-1）條件下進行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，利用高速離心機以10 000 r·min-1的條件將混合物離心10 min，分離得到上清液，利用液相色譜進行檢測，計算得到喜樹堿和羥基喜樹堿提取量，實驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素的試驗結(jié)果。利用響應(yīng)面軟件設(shè)計得出4因素三水平試驗方案，以總提取率作為響應(yīng)值，采用回歸分析方程分析得出了影響因素與實驗結(jié)果之間的函數(shù)關(guān)系，并通過回歸方程來優(yōu)化得到工藝參數(shù)，預(yù)測實驗結(jié)果，最終得到了最佳工藝條件。試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平編碼Table 1 Response surface analysis factors and horizontal coding

2 結(jié)果與分析

2.1 喜樹堿及羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照液相色譜檢測喜樹堿和羥基喜樹堿條件，縱坐標(biāo)Y 值為峰面積，橫坐標(biāo)為對照品溶液濃度（μg·mL-1），分別電腦繪圖軟件繪制喜了樹堿和羥基喜樹堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（見圖1），計算回歸方程。線性方程及相關(guān)系數(shù)為：

羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

精密度試驗結(jié)果，喜樹堿和羥基喜樹堿含量的RSD值分別為0.96%、0.95%。

圖1 喜樹堿及羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curves of camptothecin and hydroxycamptothecin

2.2 表面活性劑篩選結(jié)果

本實驗選用了4種類型的表面活性劑，包括表面活性劑陰離子型、表面活性劑陽離子型、表面活性劑兩性離子型、表面活性劑非離子型作為測試。十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉以及十六烷基三甲基溴化銨雖然對喜樹堿和羥基喜樹堿溶解度更好，但存在具有微毒性的缺點，而非離子型表面活性劑烷基糖苷是一種天然表面活性劑，具有純天然、安全可持續(xù)性、對環(huán)境不污染、容易生物降解，環(huán)境友好等特點。既能夠提取活性物質(zhì)又符合綠色化學(xué)理念，同時非離子表面活性劑具有濁點效應(yīng)，為后期喜樹堿及羥基喜樹堿的富集提供了一種安全有效的方法。喜樹堿和羥基喜樹堿在各種表面活性劑水溶液中的溶解度見圖2所示。

2.3 不同提取方法的檢測結(jié)果

本研究以喜樹堿和羥基喜樹堿提取率為檢測標(biāo)準(zhǔn)對超聲提取方法、熱回流提取法、熱浸提取法、冷浸提取法、超聲微波輔助提取法、勻漿提取法進行了分析比較。選用表面活性劑濃度8 g·L-1作為提取條件。得到喜樹堿及羥基喜樹堿的提取率如圖3所示。通過比較勻漿提取方法、超聲提取方法、冷浸提取方法對喜樹堿及羥基喜樹堿的提取率不及超聲微波輔助提取方法，而熱回流提取方法、熱浸提取方法雖然對喜樹堿及羥基喜樹堿的提取率比超聲—微波輔助提取方法高，但存在提取時間長，能耗損失大等缺點，綜合考慮，選用超聲—微波輔助提取方法更適合本實驗。

圖2 表面活性劑種類對喜樹堿和羥基喜樹堿溶解度的影響A. 椰油酰胺丙基甜菜堿；B. 十二烷基二甲基甜菜堿；C. 十二烷基苯磺酸鈉；D. 十二烷基硫酸鈉；E. 十二烷基磺酸鈉；F. 十六烷基三甲基溴化銨；G. 椰油基葡萄糖甘羥丙基三甲基氯化銨；H. 烷基糖苷Fig.2 influence of surfactant types on the solubility of camptothecin and hydroxycamptothecinA. Cocamidopropyl betaine；B. Dodecyl dimethyl betaine；C. Dodecyl benzene sulfonate；D. Dodecyl sulfate；E. Dodecyl sulfonate；F. Cetyl trimethylammonium bromide；G. Cocamidoglucosylhydroxypropyl trimethylammonium chloride；H.Alkyl glycoside

圖3 不同提取方法對羥基喜樹堿提取的影響A. 勻漿提取法；B. 超聲提取法；C. 冷浸提取法；D. 熱回流提取法；E. 熱浸提取法；F. 超聲微波輔助提取法Fig.3 Effectsofdifferentextractionmethodsonextraction of hydroxycamptothecinA.Homogenate extraction method；B.Ultrasonic extraction method；C.Cold extraction method；D. Hot reflux extraction method；E. Hot extraction method；F.Ultrasonic microwave-assisted extraction method

2.4 單因素結(jié)果

2.4.1 微波時間對提取率的影響結(jié)果

圖4 微波時間對提取結(jié)果的影響Fig.4 Effects of microwave time on extraction results

圖5 料液比對提取結(jié)果的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on extraction results

由圖4 可知，在4～12 min，喜樹堿和羥基喜樹堿提取率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，當(dāng)微波輻照時間為10 min 時，總提取率最大，為0.027 4%。這是由于微波輻照時會迅速提供給物料熱能，隨著熱能的逐漸提高，物料迅速達到一定溫度，再繼續(xù)增加微波輻照時間，物料的溫度逐漸接近烷基糖苷膠束的濁點，當(dāng)烷基糖苷產(chǎn)生濁點現(xiàn)象時會對喜樹堿和羥基喜樹堿溶解能力降低，導(dǎo)致提取量下降。因此選擇8～12 min 的范圍作為微波時間進一步優(yōu)化的范圍。

2.4.2 料液比對提取率的影響結(jié)果

由圖5 可知，在1∶10～1∶80 喜樹堿和羥基喜樹堿提取率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，在1∶60 時達到最大，為0.032 8%。由此可知最佳料液比為1∶60。因此選擇1∶40～1∶80 的范圍作為料液比進一步優(yōu)化的范圍。

圖6 微波功率對提取結(jié)果的影響Fig.6 Effect of microwave power on extraction results

圖7 表面活性劑濃度對提取結(jié)果的影響Fig.7 Effect of surfactant concentration on extraction results

2.4.3 微波功率對提取率的影響結(jié)果

由圖6 可知，在100～1 000 W 提取率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，在700 W 時喜樹堿提取率達到最大，在900 W 時羥基喜樹堿提取率達到最大。由此可知最佳微波功率為喜樹堿700 W、羥基喜樹堿900 W。因此選擇700～1 000 W 的范圍作為微波功率進一步優(yōu)化的范圍。

2.4.4 表面活性劑濃度對提取率的影響結(jié)果

由圖7 可知，在2～12 g·L-1提取率呈現(xiàn)先升高后逐漸平穩(wěn)的趨勢，在8 g·L-1時達到最大，為0.059 89%。由此可知最佳微波時間為8 g·L-1。因此選擇6～10 g·L-1的范圍作為表面活性劑濃度進一步優(yōu)化的范圍。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Response surface test design and test results

2.5 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.5.1 響應(yīng)曲面法設(shè)計喜樹堿及羥基喜樹堿提取工藝

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，利用響應(yīng)面軟件對實驗進行設(shè)計處理，采用烷基糖苷50%水溶液為提取溶劑，喜樹葉粉末為材料，超聲—微波輔助提取為基本方法，分別以微波時間、料液比、微波功率、表面活性劑濃度4 個因素為自變量，喜樹堿和羥基喜樹堿總提取率為響應(yīng)值，設(shè)計了該實驗，共29次，其中包含5次中心實驗，試驗結(jié)果見表2。

2.5.2 數(shù)學(xué)模型的建立及分析

利用響應(yīng)面軟件對表2 中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，最終得到多元回歸模型為：

Y=-0.577 52+0.034 359A+0.168 6B+0.168 6B+0.0926C+0.03031D-0.0459AB-0.0217AC-0.0788AD-0.00863BC-0.0472BD-0.0166CD-0.1618A2-0.0239B2-0.001 5C2-0.165 4D2

隨后對膠束介導(dǎo)超聲—微波輔助提取喜樹堿和羥基喜樹堿的提取率模型進行分析處理，以實現(xiàn)對該模型的準(zhǔn)確性進行驗證，分析結(jié)果見表3。透過表3可獲知，其中F=15.47，P＜0.0001，該項顯示結(jié)果良好，說明在描述各個影響因素與影響值之間的關(guān)系，因變量和全體自變量之間建立的喜樹堿和羥基喜樹堿總提取率的模擬回歸方程極顯著，準(zhǔn)確率高，方法可靠。由表3分析結(jié)果可知，試驗的失擬項P=0.999 6＞0.05，該項結(jié)果呈現(xiàn)不顯著狀態(tài)，結(jié)果表明模擬回歸方程擁有很高的擬和程度，試驗結(jié)果準(zhǔn)確，模型真實合理，可以對試驗結(jié)果的預(yù)測。同時，從表中可以得知該模型的R2＝0.867 3，說明試驗結(jié)果是大概率事件，86.7%的可能試驗結(jié)果是受試驗各實驗因素影響，模型模擬度良好，試驗準(zhǔn)確度高，由此可得出結(jié)論該模型可以用來指導(dǎo)分析預(yù)測喜樹堿和羥基喜樹堿提取工藝條件。由表3可知，回歸模型中AD、AB、AC、BC、BD、CD對總提取率的影響顯著（P＜0.05），A、D、B2對總提取率的影響極顯著（P＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 results of variance analysis of regression model

2.5.3 響應(yīng)面交互分析

圖8～13 是經(jīng)軟件處理后得到的響應(yīng)面圖，以下圖中是當(dāng)其中一個變量保持恒定值時其他2 個變量之間的相互作用。下圖結(jié)合表3 可知，AB 之間的P 值為0.009 3，由此可知影響結(jié)果顯著，說明微波時間與料液比之間的相互作用對總提取率存在影響。料液比一定時，微波時間對總提取率的影響先升高再趨于平緩之后略減，當(dāng)微波時間不變時，料液比先升高再降低。

AC 之間P 值為0.009 9，由此可知影響顯著，說明微波時間與表面活性劑濃度之間的相互作用對總提取率存在影響。表微波功率一定時，微波時間對總提取率的影響先升高再降低，當(dāng)微波時間不變時，微波功率先升高后趨于平穩(wěn)之后略減。

AD 之間P 值為0.079 7，說明微波時間與表面活性劑濃度之間的相互作用對總提取率存在影響。表面活性劑濃度一定時，微波時間對總提取率的影響先升高，在趨于平緩之后略減，當(dāng)微波時間不變時，表面活性劑濃度先升高后趨于平穩(wěn)。

BC 之間P 值為0.007 0，說明料液比與微波功率的相互作用對總提取率存在影響。料液比一定時，微波功率對總提取率的影響先升高，在趨于平緩之后略減，當(dāng)微波功率不變時，料液比先升高后降低。

BD 之間P 值為0.007 9，說明料液比與表面活性劑濃度之間的相互作用對總提取率存在影響。料液比一定時，表面活性劑濃度對總提取率的影響先升高在趨于平緩，當(dāng)表面活性劑濃度不變時，料液比先升高后降低。

CD 之間P 值為0.038 4，說明微波功率與表面活性劑濃度之間的相互作用對總提取率存在影響。微波功率一定時，表面活性劑濃度對總提取率的影響先升高在趨于平緩之后略減，當(dāng)表面活性劑濃度不變時，微波功率先升高后降低。

圖8 微波時間與料液比交互作用影響Fig.8 The interaction between microwave time and material-liquid ratio

圖9 微波時間與微波功率交互作用影響Fig.9 The interaction between microwave time and microwave power

2.5.4 響應(yīng)面優(yōu)化與分析

經(jīng)過響應(yīng)面軟件計算分析對回歸方程結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析處理，確定了最佳工藝參數(shù)為微波時間10.51 min、料液比1∶61.70、微波功率867.82 W、表面活性劑濃度8.53 g·L-1，在該工藝條件下理論預(yù)測總提取率為0.056 4%。根據(jù)上述最佳參數(shù)并結(jié)合實際試驗的合理性，將工藝條件修正為微波時間10.5 min、料液比1∶60、微波功率850 W、表面活性劑濃度8.5 g·L-1。對于得到的工藝參數(shù)進行平行實驗總計3次，得到喜樹堿和羥基喜樹堿總提取率的平均值為0.054 96%。得到的結(jié)果與理論預(yù)測值0.056 4%相比較，結(jié)果相當(dāng)接近，證明了響應(yīng)面模型的真實有效性，由此可以確定可以使用響應(yīng)面對喜樹堿和羥基喜樹堿總提取率進行準(zhǔn)確預(yù)測與分析。

圖10 微波時間與表面活性劑濃度交互作用影響Fig.10 Microwave time interacts with surfactant concentration

圖11 料液比與微波功率交互作用影響Fig.11 The interaction between material-liquid ratio and microwave power

2.5.5 驗證實驗

經(jīng)過響應(yīng)面軟件計算分析得到實驗最優(yōu)條件：微波時間10.5 min，料液比1∶60，微波功率850 W，表面活性劑濃度8.5 g·L-1。根據(jù)最優(yōu)條件指導(dǎo)進行驗證試驗，重復(fù)3次從喜樹葉中提取喜樹堿和羥基喜樹堿，得到平均提取率為0.054 96%，與預(yù)測值0.056 4%接近。

圖12 料液比與表面活性劑濃度交互影響Fig.12 The ratio of material to liquid interacts with the concentration of surfactant

圖13 微波功率與表面活性劑濃度交互影響Fig.13 Microwave power interacts with surfactant concentration

3 討論

本試驗選取資源豐富的喜樹葉為提取原料，用表面活性劑水溶液為提取溶液，選取了4個影響因素，分別為微波時間、料液比、微波功率、表面活性劑濃度，同時將喜樹堿和羥基喜樹堿的提取率作為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化了喜樹堿和羥基喜樹堿超聲—微波提取的工藝，通過分析得到了該實驗的模擬回歸方程，經(jīng)上述試驗證明，該模擬方程擬合結(jié)果準(zhǔn)確，可以利用該方程去預(yù)測喜樹堿和羥基喜樹堿提取率。