苗永美 童 元 方 達 王宇豪

（安徽科技學院生命與健康科學學院，鳳陽 233100）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，也是我國傳統(tǒng)珍惜名貴中藥材之一。古代醫(yī)學經(jīng)典著作中均有記載，鐵皮石斛在道家經(jīng)典《道藏》被譽為“中華九大仙草”之首。鐵皮石斛味甘、性微寒，具生津養(yǎng)胃、滋陰清熱、潤肺益腎、明目強腰、抗腫瘤及提高免疫力等功效［1］。

野生鐵皮石斛主要分布在安徽、浙江、福建、云南等地，生于海拔1 600 m 的山地半陰濕的懸崖峭壁處或長滿青苔的巖石或樹上，喜歡空氣濕度大、冷涼環(huán)境。鐵皮石斛野生資源急劇減少，分別于1987 和1992 年被列為“三級保護品種”和“瀕危植物”。利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖種苗后進行人工栽培已在安徽、江蘇、浙江等省份開展的如火如荼，但種植鐵皮石斛需要模擬原生境高投入，且管理精細。鐵皮石斛的離體無性繁殖技術(shù)己基本成熟，包括叢苗的繁殖、壯苗生根、原球莖誘導增殖、懸浮培養(yǎng)等；開展的研究主要集中在基本培養(yǎng)基選擇、激素優(yōu)化、有機附加物的添加、活性炭的使用等方面［2］。此外，鐵皮石斛成分積累影響因素如光質(zhì)［3］、培養(yǎng)方法［4］、栽培生長環(huán)境［5～6］、內(nèi)生菌［7～8］等研究也有少量報道。根據(jù)作者近年來研究和文獻報道，鐵皮石斛離體繁殖中仍然存在不定芽誘導率低、植株生長緩慢及促進植株生長和藥用成分合成的誘導子研究不夠全面等問題。稀土尤其是鑭元素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常用，有促進植物生長和代謝產(chǎn)物合成及提高抗逆等功能。研究表明，硝酸鑭能促進細莖石斛生長［9］，也能促進鐵皮石斛組培苗生長及提高酶活性［10］；鐵皮石斛盆苗噴施鑭溶液能促進光合、增強抗逆和提高多糖及石斛堿含量［11］。鐵皮石斛有效成分主要有多糖、生物堿、菲類化合物、聯(lián)芐、酚酸、黃酮等［12］。目前，鑭在鐵皮石斛上的研究相對單一，對產(chǎn)物的種類研究少，對誘導不定芽的影響未見報道。本試驗在鐵皮石斛不同離體培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中添加硝酸鑭來研究鑭對不定芽分化、植株生長及4種代謝產(chǎn)物合成的影響，并進行相關(guān)性分析。為后期鐵皮石斛細胞規(guī)?；囵B(yǎng)和高產(chǎn)、高品質(zhì)栽培奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)服務。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛無菌苗從六安市西山生物技術(shù)有限公司購買，在本實驗室繼代擴繁得到大批組培苗。

1.2 方法

1.2.1 莖段培養(yǎng)的La3+處理

組培苗經(jīng)繼代擴繁后，選取健壯、粗細基本一致的莖條，節(jié)處切開，形成兩端帶節(jié)的單莖段，接種在添加硝酸鑭的M1（MS+6-BA 0.6 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1）上，使La3+濃度為0、30、50、70、90、110、130、150μmol·L-1，每個處理接種10瓶，每瓶6個莖段，3個月后統(tǒng)計芽數(shù)、稱芽苗鮮重。

1.2.2 組培苗生長期的La3+處理

選擇粗壯、大小基本一致的鐵皮石斛從苗稱初始鮮重，計Fw1，接入添加硝酸鑭的M2（MS+6-BA 0.25 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1）上，使La3+濃度為0、30、50、70、90、110、130、150 μmol·L-1，每處理4瓶。3 個月轉(zhuǎn)接1 次，培養(yǎng)6個月后測葉綠素含量；稱鮮重，計Fw2；去根和葉后稱鮮重，計Fw3；烘干稱干重，計Dw；測干品中多糖、黃酮、總酚和聯(lián)芐含量。

以上培養(yǎng)基需添加1 g·L-1的活性炭、100 g·L-1土 豆 汁、30 g·L-1蔗 糖、7.5 g·L-1瓊 脂 粉，pH=6.5～7.0。光 照 時 間 為12 h·d-1，光 照 強 度 為40μmol·m-2·s-1，溫度25±2℃。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 莖段培養(yǎng)相關(guān)指標測定

培養(yǎng)3 個月后，計數(shù)出芽的莖段數(shù)和總芽數(shù)，稱芽苗的鮮重，根據(jù)公式計算出芽率、平均芽數(shù)，平均鮮重。

1.3.2 叢苗培養(yǎng)相關(guān)指標測定

叢苗培養(yǎng)6 個月后，隨機抽取10 株，用SPAD-502PLUS葉綠素儀測量第二葉的SPAD，測3次，均值為該葉片的葉綠素含量；根據(jù)公式Fw2/Fw1 計算增重倍數(shù)；去葉和根后的鮮條70℃烘15 h 得干品，根據(jù)公式Dw/Fw3計算干鮮比。

1.3.3 4種次生代謝產(chǎn)物含量測定

干品研磨，過60 目篩。精密稱取樣品0.5 g，加30 mL 蒸餾水，90℃水浴提取3 h，按照苗永美等［13］方法得樣品多糖液和葡萄糖標準曲線，計算多糖含量（mg·g-1）。樣品0.5 g，加30 mL 70%乙醇，70℃加熱回流2 h，離心，得上清液，用于黃酮、酚酸和聯(lián)芐含量的測定?？傸S酮含量測定以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法［14］；總酚酸含量測定以沒食子酸為標準品，采用福林酚法［14］；聯(lián)芐類物質(zhì)的測定以石斛酚為對照品，按照賈芳等方法［15］用紫外分光光度法測定，得回歸方程A=15.511C（mg·mL-1）+0.003 7?；钚猿煞譁y定每處理做3組平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用Microsoft Excel 2010 和SPSS19.0 進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，采用方差分析和Duncan 新復極差法比較分析稀土鑭對鐵皮石斛不定芽誘導、組培苗生長和4種成分合成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度La3+對莖段出芽及生長的影響

本研究結(jié)果（見表1）表明，30～150μmol·L-1的La3+能促進鐵皮石斛莖段不定芽的分化及芽苗生長，50μmol·L-1處理上其誘導率最高，顯著高于其他處理。芽數(shù)這項指標更能綜合說明培養(yǎng)效果。La3+濃度在70～90 μmol·L-1時萌發(fā)形成的芽較多（2.78～2.83 個），顯著高于其他處理。50～90μmol·L-1的La3+促進芽苗生長的效果顯著，每瓶鮮重在3.97～4.16 g。莖段培養(yǎng)目的是為了獲得更多的芽苗，且長勢強壯，根據(jù)這一評價標準，認為添加70～90 μmol·L-1的La3+對莖段不定芽誘導和生長效果最好。

2.2 不同濃度La3+對叢苗生長的影響

由圖1 看出，隨La3+濃度升高，葉綠素含量先逐漸升高后降低，但只有130 μmol·L-1的La3+處理上的植株其葉綠素含量與對照差異顯著，含量為70.2 SPAD，比對照提高了9.76%。

不同濃度La3+對鐵皮石斛叢苗生長的影響見表2，鑭處理下鮮重都有所增加，其中，110～130μmol·L-1La3+處理上植株增重倍數(shù)較大，顯著高于對照組，其中110 μmol·L-1時增重倍數(shù)最高，為15.22，比對照提高了107.64%；110μmol·L-1的La3+最有利于鐵皮石斛干物質(zhì)的積累，干重/鮮重比（以下簡稱干鮮比）為12.05∶100，對照提高了64.39%。

表1 La3+添加量對莖段離體培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of La3+concentration on culture in vitro of stem segments

圖1 La3+添加量對植株葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of La3+concentration on chlorophyll content

表2 La3+添加量對生物量的影響Table 2 Effects of La3+concentration on plants biomass

2.3 不同濃度La3+對4種代謝產(chǎn)物含量的影響

鐵皮石斛干品中4 種代謝產(chǎn)物含量的變化見表3。一定濃度的La3+有利于多糖、黃酮、酚酸和聯(lián)芐的合成，30～110μmol·L-1La3+處理上其多糖合成能力顯著高于對照，110μmol·L-1處理上其多糖含量最高，為98.84 mg·g-1，比對照提高了27.96%；超過130 μmol·L-1時，多糖合成受到顯著性的抑制。隨La3+濃度的升高，黃酮、酚酸和聯(lián)芐含量均出現(xiàn)先升高后降低趨勢，90μmol·L-1處理上3種成分含量最高，分別為4.31，7.56 和21.01 mg·g-1，比對照顯著提高了41.31%，13.35%，73.35%。

表3 La3+添加量對4種代謝產(chǎn)物含量的影響Table 3 Effects of La3+concentrationon the contents of 4 metabolites

2.4 指標的相關(guān)分析

由表4可知，葉綠素含量僅與聯(lián)芐含量的相關(guān)性顯著，與其他5 個指標相關(guān)性不顯著；增重倍數(shù)與干鮮比、聯(lián)芐含量之間的相關(guān)性都達到顯著水平；干鮮比與4種代謝產(chǎn)物含量相關(guān)性都不顯著；4種產(chǎn)物含量之間相關(guān)性顯著的有多糖與酚酸、總黃酮與總酚、總黃酮與聯(lián)芐。根據(jù)相關(guān)系數(shù)的平均值，每項指標與其他6項指標相關(guān)性從大到小依次為：聯(lián)芐含量＞總黃酮含量＞干鮮比＞增重倍數(shù)＞多糖含量＞總酚含量＞葉綠素含量。

表4 指標的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficient analysis of Indexes

3 討論

稀土在植物土培、水培或組培等領(lǐng)域都有應用，可以施加到栽培基質(zhì)中，也可噴施到植株上。植物組織培養(yǎng)過程中添加合適濃度的稀土有促進組培苗分化、生長、愈傷組織形成、再分化及改善品質(zhì)的作用，已被廣泛應用到藥用植物離體培養(yǎng)［9～11，16～18］。不同植物所需的稀土種類、濃度和添加時間不盡相同，可能是由于不同植物不同時期的酶活性、細胞分泌等功能受金屬離子的影響不同。因此，植物增產(chǎn)、改善品質(zhì)所需的稀土濃度需不斷摸索。作者在進行長期的鐵皮石斛組培中發(fā)現(xiàn)，石斛苗生長緩慢，繼代周期3 個月。前期研究還表明鐵皮石斛莖段離體培養(yǎng)中，存在出芽部位要求特殊及外植體易褐化死亡等問題，往往在節(jié)處形成芽點而節(jié)間極難出芽，采取的措施是在節(jié)處切割形成兩端帶節(jié)點的培養(yǎng)物，即便如此，莖段不定芽誘導率仍然很低、芽數(shù)少。本試驗采用培養(yǎng)基中添加硝酸鑭的方式研究La3+的作用，表明70～90μmol·L-1的La3+能顯著促進莖段不定芽的形成和生長。130μmol·L-1的La3+能顯著提高組培苗葉綠素含量，植株在含110μmol·L-1La3+培養(yǎng)基上生長最好，鮮重增加顯著，干物質(zhì)增加最多，張桂芳研究表明30～40 mg·L-1的硝酸鑭能明顯提高鐵皮石斛組培苗鮮重、株高等，明顯降低分蘗數(shù)，10～40 mg·L-1的硝酸鑭能顯著提高葉綠素含量［10］；鐵皮石斛盆苗噴施20 mg·L-1的氯化鑭后葉綠素含量比對照提高了54.37%［11］；培養(yǎng)基中添加15 mg·L-1硝酸鑭處理組的霍山石斛與對照組長勢相當，隨濃度增加，側(cè)芽高度和增殖倍數(shù)受到抑制［19］；當然也有稀土對葉綠素影響不明顯的研究報道，如硝酸鑭對細莖石斛葉綠素含量影響差異不顯著［9］。本研究相關(guān)性分析表明葉綠素含量與植株生長量呈正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著，說明植株的生長還有可能是因La3+激活了其他生理指標的改變，如有研究指出La3+在促進了鐵皮石斛生長的同時，也提高了植株SOD 酶、CAT 酶和根系活力［12］。另有研究指出稀土對紫草的促生也與酶活的提升有關(guān)系［18］；但有研究表明La3+是通過與細胞壁的結(jié)合以改變細胞的通透性來增加細胞對部分營養(yǎng)離子的吸收，也可能是通過刺激細胞有絲分裂使生物量增加［20～21］。

近年來，鑭在提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物合成方面研究取得了較大進展，如在東北紅豆杉細胞生長指數(shù)期加入5.8μmol·L-1的鑭可促進紫杉醇合成和釋放［22］；鑭亦能顯著促進掌葉大黃毛狀根的生物量和蒽醌［23］及人參毛狀根皂苷［24］的合成。然而稀土鑭對石斛品質(zhì)的改善研究較少，徐曉燕等用20 mg·L-1的氯化鑭噴施鐵皮石斛盆苗30 d后，葉和莖稈中可溶性蛋白、脯氨酸、多糖含量和石斛堿含量都比對照有了增加，改善了品質(zhì)［11］。本試驗180 d 的La3+處理改善了鐵皮石斛品質(zhì)，但不同代謝產(chǎn)物的合成需要不同濃度La3+誘導，多糖合成需要的最佳濃度為110 μmol·L-1，黃酮、酚酸和聯(lián)芐合成的最佳La3+濃度處理是90 μmol·L-1，3種醇提物中，鑭對聯(lián)芐的代謝強度提升幅度最大，黃酮次之，酚酸最小。調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成所需鑭濃度因植物和產(chǎn)物而異，促進代謝物合成的機理也因代謝產(chǎn)物和途徑而異［20～24］。人參皂苷積累中是因La3+促進了皂苷合成中鯊烯合成酶（PgSS）和達瑪烯二醇合成酶（PgDDS）的表達，而對β-香樹素合成酶（Pg βAS）合成無明顯影響［24］；丹參毛狀根中，La3+通過直接誘導丹參酮類和酚酸類生物合成代謝關(guān)鍵酶基因來提升其含量［25］；而La3+和Ce3+提高懷槐懸浮細胞中黃酮含量是通過改變細胞的氧化還原狀態(tài)，進而間接影響苯丙氨酸裂解酶的表達來調(diào)控黃酮合成［26］。關(guān)于La3+促進鐵皮石斛4 種代謝產(chǎn)物合成的機理有待進一步研究。

葉綠素是植物光合作用的主要色素，葉綠素含量越高，光合能力就越強，植物生長也就越好。本研究表明，鑭處理的鐵皮石斛其生長與葉綠素變化相關(guān)性不顯著，代謝物中只有聯(lián)芐與葉綠素相關(guān)性顯著，說明鑭元素是通過改變了其他理化指標而促進了生長及產(chǎn)物合成。根據(jù)相關(guān)系數(shù)的平均值看出聯(lián)芐和黃酮含量與其他5 個指標受稀土鑭調(diào)控變化較為一致，且受鑭調(diào)控影響較大，這兩種代謝產(chǎn)物可作為下一步開展鑭調(diào)控下應用生產(chǎn)或機理研究的主要目標產(chǎn)物。